Вакцина

1. Вакцина, яка включає сапоніновий глікозид, стерол та антиген, яка відрізняється тим, що вказаний сапоніновий глікозид і вказаний стирол зв'язані один з одним з утворенням комплексів у формі спіральних міцел, причому вказаний антиген C2 2 (19) 1 3 89631 4 рганізмів або очищені білкові субодиниці, імунітет, ланцюгами жирних кислот, загалом, довжиною від спричинений такими антигенами, є слабким і, таС12 до С16), цитокіни, вуглеводні полімери, похідким чином, необхідне додавання певних екзогенні полісахаридів, а також бактеріальні токсини, такі них матеріалів як ад'юванту. Крім того, виробництяк токсин холери і лабільний токсин (ЛТ) E. coli. во синтетичних та субодиничних вакцин є дорогим. Деякі з добре відомих ад'ювантів являють соТаким чином, при використанні ад'юванту для бою комбінації некорпускулярних імуномодулятостимуляції імунної реакції може бути потрібна мерів і корпускулярних матеріалів, які можуть наданша доза антигену, що дозволяє зменшити собівати ад'ювантній композиції депо-ефекту. вартість виробництва вакцин. Наприклад, ПАФ поєднує імуномодулювальні влаВідомо, що ад'юванти здійснюють свою дію стивості компонентів Mycobacterium tuberculosis для підсилення імунної реакції численними різноразом з короткостроковим депо-ефектом масляних манітними шляхами. Багато ад'ювантів модифікуемульсій. ють цитокінну мережу, пов'язану з імунною реакціМасляні емульсії використовують протягом єю. Такі імуномодулювальні ад'юванти можуть тривалого часу як ад'юванти для вакцин. Le здійснювати свою дію навіть якщо вони не поєднаMoignic та Pinoy в 1916p. виявили, що суспензія ні з антигенами. В цілому імуномодулювальні вбитих мікроорганізмів Salmonella typhimuhum в ад'юванти спричиняють загальну регуляцію вгору мінеральному маслі підсилює імунну реакцію. Далі деяких цитокінів і супутню регуляцію вниз інших, в 1925p. Ramon описав крохмальну олію (starch що веде до клітинної Th1 та/або гуморальної Тп2 oil) як одну з речовин, що підсилюють антитоксичреакції. ну реакцію на дифтерійний анатоксин. Однак масДеякі ад'юванти володіють здатністю зберігати ляні емульсії не набували поширення до 1937p., конформаційну суцільність антигену таким чином, коли Фрейнд ввів у використання свою ад'ювантну що антиген може бути ефективно представлений композицію, відому як Повний Ад'ювант Фрейнда відповідним імунним ефекторним клітинам. В ре(ПАФ). ПАФ являє собою емульсію вода-у-маслі, зультаті такого збереження конформації антигену яка складається з мінерального (парафінового) ад'ювантною композицією вакцина буде мати збімасла, змішаного з вбитими мікобактеріями та льшений термін придатності, як це продемонстроАрлацелом A (Arlacel А). Арлацел А являє собою, вано для імуностимулювальних комплексів в основному, маніту моноолеат і використовується (ISCOMs). Ozel M., et. al.; Quartemary Structure of як емульгуючий агент. Хоча ПАФ володіє чудовиthe Immunestimulating Complex (Iscom), J. of ми властивостями з точки зору викликання імунної Ultrastruc. and Molec. Struc. Res. 102, 240-248 реакції, його введення спричиняє сильний біль, (1989). утворення абсцесу, гарячку та гранулематозне Деякі ад'юванти володіють здатністю утримузапалення. Для уникнення таких небажаних побічвати антиген як депо в місці ін'єкції. В результаті них реакцій було створено Неповний Ад'ювант такого депо-ефекту не відбувається швидкої втраФрейнда (НАФ). За складом НАФ подібний до ти антигену шляхом печінкового кліренсу. АлюміПАФ, за винятком відсутності мікобактеріапьних нієві солі та емульсії масло-у-воді діють шляхом компонентів. НАФ діє шляхом утворення депо в такого депо-ефекту для препаратів з короткою місці ін'єкції і повільного вивільнення антигену із тривалістю дії. Наприклад, можна одержати депо стимуляцією продукуючих антитіла клітин. тривалої дії з використанням повного ад'юванту Інший підхід до вдосконалення ПАФ базувався Фрейнда (ПФА, FCA), що являє собою емульсію на спостереженнях щодо того, що заміна мінерамасло-у-воді. ПАФ типово залишається в місці льного масла на біологічно сумісне масло допомаін'єкції до тих пір, поки біологічне розкладання догає усунути пов'язані з ПАФ реакції в місці ін'єкції. зволяє вилучення антигену антигенТакож вважалося, що емульсія повинна бути скопредставляючими клітинами. ріше типу масло-у-воді, ніж вода-у-маслі, оскільки На базі своєї фізичної природи ад'юванти моостання утворює депо довгострокової дії в місці жуть бути згруповані в дві дуже широкі категорії, а ін'єкції. Hilleman із співавт. описали ад'ювант на саме корпускулярні (корпускулярні) ад'юванти та базі масла "Ад'ювант 65" ("Adjuvant 65я, який скланекорпускулярні (некорпускулярні) ад'юванти. Кодається з 86% арахісового масла, 10% Арлацела рпускулярні ад'юванти існують у вигляді мікрочасА як емульгатора і 4% алюмінію моностеарату як тинок. Імуноген здатний або поєднуватися (інкорстабілізатора. Hilleman, 1966, Prog. Med. Virol. 8: поруватися) або зв'язуватися з мікрочастинками. 131-182; Hilleman and Beale, 1983, в New Прикладами корпускулярних ад'ювантів є алюмініApproaches to Vaccine Development (Eds. Bell, R. єві солі, емульсії вода-у-маслі, емульсії масло-уand Torrigiani, G.), Schwabe, Basel. У людей Ад'юводі, імуностимулювальні комплекси, ліпосоми, а вант 65 був безпечним і потужним, але виявляв також нано- і мікрочастинки. Некорпускулярні менш виражені ад'ювантні властивості, ніж НАФ. В ад'юванти загалом являють собою імуномодулябудь-якому випадку, використання Ад'юванту 65 тори і звичайно їх використовують в поєднанні з було припинено внаслідок реактогенності певних корпускулярними ад'ювантами. Прикладами некосерій вакцин у людей і зниження ад'ювантних вларпускулярних ад'ювантів є дипептид мурамілу стивостей при використанні очищеного або синте(компонент з активністю ад'ювантного пептидоглітичного емульгатора замість Арлацела А. У Патекану, екстрагованого з мікобактерій), неіонні блокнтах США 5,718,904 та 5,690,942 вказано, що співполімери, Сапоніни (комплексні суміші тритермінеральне масло в емульсії масло-у-воді може пеноїдів, екстрагованих з кори дерева Quillaja бути замінене на масло, яке піддається метаболіsaponaria, Ліпід А (дисахарид глюкозаміну з двома зму, з метою покращення профілю безпечності. фосфатними залишками і п'ятьма або шістьма 5 89631 6 Окрім ад'ювантних властивостей і безпечності 5,376,369 розкриває субмікронну ад'ювантну комважливою з комерційної точки зору властивістю є позицію у вигляді емульсії масло-у-воді, відому як зовнішній вигляд емульсії. Зовнішній вигляд залеАд'ювантна Композиція Синтакс (Syntax Adjuvant жить від стабільності емульсії. Відшаровування, Formulation, САК). САК містить як масляний комосадження та злиття є показниками нестабільності понент сквален або сквалан, и придатній для емульсії. Відшаровування виникає, коли масляна і утворення емульсії кількості Pluronic L121 (поліокводна фази емульсії мають різну питому вагу. Вісипропілен-поліоксиетилен) блок-співполімера та дшаровування також виникає, коли початковий імунопотенціювапьну кількість дипептиду мурамірозмір краплинок емульсії є великим і краплинки лу. Сквален являє собою лінійний вуглеводневий емульсії не приймають участі в броунівському рупрекурсор холестерину, знайдений в багатьох ткаху. Якщо розмір краплинок є великим, існує тенденинах, особливо в печінці акул та інших риб. Скванція до міжфазового розриву і краплинки зливалан одержують шляхом гідрогенізації сквалену і ються у частинки великого розміру. Стабільність він являє собою повністю насичену сполуку. Скваемульсії визначається численними факторами, лен і сквалан можуть метаболізуватися і демонтакими як природа та кількість використаного емуструють сприятливі показники по результатам токльгатора, розмір краплинок в емульсії та різниця в сикологічних досліджень. Емульсії сквалену або щільності між масляною і водною фазою. сквапану використовували в протиракових вакциЕмульгатори сприяють стабілізації диспергонах для людини, які продемонстрували легкі побіваної краплинки шляхом зменшення вільної міжчні ефекти і бажану ефективність. Див., наприфазової поверхневої енергії та створення фізичклад, Anthony С. Allison, 1999, Squalene and них або електростатичних бар'єрів до з'єднання Squalane emulsions as adjuvants, Methods 19:87-93. краплинок. Як емульгатори використовують неіонУ Патенті США 6,299,884 та міжнародній патені, а також іонні детергенти. Неіонні емульгатори нтній заявці WO 90/14837 вказано, що поліоксипорієнтовані до межі фаз та утворюють відносно ропілен-поліоксиетилен блок-співполімери не є об'ємисті структури, які ведуть до стеричного ухисуттєвими для утворення субмікронної емульсії лення диспергованих краплинок. Аніонні або катімасло-у-воді. Більше того, вказані посилання розонні емульгатори індукують утворення подвійного кривають використання нетоксичного масла, яке електростатичного шару шляхом притягнення прометаболізується, та виразно виключають використиіонів; відштовхувальні сили подвійного шару тання в розкритих рецептурах емульсій мінеральпримушують краплинки при зближенні відштовхуного масла і токсичних масел, одержаних в ревати одна одну. зультаті перегонки нафти. Окрім використання емульгаторів стабільність Патент США 5,961,970 розкриває іншу субмікемульсії також може бути досягнута шляхом змеронну емульсію масло-у-воді для застосування в ншення розміру краплинки емульсії механічними ролі ад'юванту вакцини. В емульсії, описаній в засобами. Для виробництва емульсій типово викоданому патенті, гідрофобний компонент вибираристовують пропелерні міксери, турбінні ротори, ють з групи, яка складається з тригліцеридного колоїдні млини, гомогенізатори та ультразвукові масла з середньою довжиною ланцюга, рослинної апарати. Мікрофлюїдизація являє собою інший олії та їхньої суміші. Включена до цієї емульсії шлях підвищення гомогенності розміру краплинок поверхнево-активна речовина може бути природв емульсії. Мікрофлюїдизація може утворювати ною біологічно сумісною поверхнево-активною витончену, фізично стабільну емульсію з системаречовиною, такою як фосфоліпід (наприклад, летичним розміром частинок в субмікронному інтерцитин), або фармацевтично прийнятною синтетичвалі. Окрім підвищення стабільності емульсії проною поверхнево-активною речовиною, такою як цес мікрофлюїдизації дозволяє здійснити кінцеву Твін-80. Вказаний патент також розкриває інкорпофільтрацію, яка є переважним шляхом забезперування антигену в емульсію під час утворення чення стерильності кінцевого продукту. Більше емульсії, на протилежність змішуванню антигену з того, субмікронні частинки масла можуть проходиемульсією після того, як емульсія була незалежно ти від місця ін'єкції в лімфатичну систему і далі до та зовнішньо утворена. лімфатичних вузлів дренажного ланцюга, кров та В Патенті США 5,084,269 вказано, що ад'юваселезінку. Це зменшує ймовірність утворення маснтна композиція, яка містить лецитин в комбінації з ляного депо в місці ін'єкції, яке може спричиняти мінеральним маслом, спричиняє зменшення подмісцеве запалення і значну реакцію в місці ін'єкції. разнення у тварини-хазяїна і одночасно індукує На сьогоднішній день мікрофлюїдизатори є підвищений системний імунітет. Ад'ювантна комкомерційно доступними. Утворення емульсії здійспозиція за Патентом США 5,084,269 застосовуєтьнюється у мікрофлюїдизаторі з використанням ся на комерційних засадах у ветеринарних вакцидвох флюїдизованих потоків, які взаємодіють на нах під торгівельною назвою Амфіген високих швидкостях в камері взаємодії. Робота (AMPHIGEN ). Рецептура Амфігену утворена мімікрофлюїдизатора здійснюється за рахунок повіцелами - масляними краплинками, оточеними летря або азоту і він може працювати при значеннях цитином. Вказані міцели дозволяють приєднання внутрішнього тиску з надлишком більшої кількості антигенів суцільних клітин, ніж 2 20000фунт/дюйм . Патент США 4,908,154 розкритрадиційні ад'юванти на базі масла. Більше того, ває використання мікрофлюїдизатора для одеркомбінації вакцин на базі Амфігену містять малу жання емульсій, істотною мірою вільних від емулькількість масла (2,5-5% мінерального масла) в гуючих агентів. порівнянні з іншими препаратами вакцин, які місЧисленні субмікронні ад'ювантні композиції тять масляні ад'юванти, де вміст масла типово масло-у-воді розкриті в літературі. Патент США становить від 10% до 20%. Низький вміст масла 7 89631 8 веде до зменшення подразнення тканин в місці Емульсії масло-у-воді за даним винаходом ін'єкції таким вакцинним препаратом на базі ад'юможуть включати додаткові компоненти, які є приванту, що веде до меншої кількості уражень і медатними і бажаними, в тому числі консерванти, ншого TRIM AT SLAUGHTER. Крім того, лецитиноосмотичні агенти, біоадгезивні молекули та імунове покриття, яке оточує масляні краплинки, стимулювальні молекули. Переважні імуностимудодатково зменшує реакції в місці ін'єкції, що долювальні молекули включають, наприклад, Квіл-А зволяє одержати вакцину, яка є безпечною і вод(Quil А), холестерин, GPI-100, диметилдіоктадециночас ефективною. ламонію бромід (ДДА). Препарат Амфіген використовується як ад'юВ іншому варіанті даний винахід забезпечує вант в численних ветеринарних вакцинах, і, таким способи одержання субмікронної емульсії масло-учином, існує потреба у збереженні зовнішнього воді. У відповідності до даного винаходу різні комвигляду вакцинного продукту під час короткочаспоненти емульсії, в тому числі масло, одну або них і тривалих періодів зберігання, а також під час більше поверхнево-активних речовин, водний розбавлення. Крім того, ліофілізований антиген компонент та будь-який інший компонент, придатзмішують з попередньою виготовленою ад'ювантний для використання в емульсії, змішують разом. ною композицією безпосередньо перед ін'єкцією. Суміш піддають процесу первинного емульгування Така практика не завжди забезпечує однорідний з утворенням емульсії масло-у-воді, яку далі пророзподіл антигену в емульсії масло-у-воді, внасліпускають крізь мікрофлюїдизатор з одержанням док чого зовнішній вигляд емульсії може бути неемульсії масло-у-воді, що містить краплинки діазадовільним. Крім того, при стоянні може відбуваметром менше 1мкм, переважно з середнім розмітися розділення фаз попередньо гомогенізованої ром краплинки менше 0,5мкм. емульсії. Таким чином, існує потреба у стабільній В іншому варіанті даний винахід забезпечує ад'ювантній композиції, в якій при тривалому збекомпозиції вакцин, які містять антиген та субмікріганні не відбувається розділення фаз. Одним із ронну емульсію масло-у-воді, раніше описану в способів запобігання розділенню фаз є зменшення даному описі. Антиген введений в емульсію зовнірозміру краплинок та збільшення гомогенності шньо або внутрішньо, переважно, внутрішньо. частинок в емульсії. Хоча спосіб мікрофлюїдизації Антиген, який може бути включений в компоемульсійних препаратів на базі масла, що метабозиції вакцин за даним винаходом, може бути баклізується, описаний, до цього часу мікрофлюїдитеріальним, грибковим або вірусним антигеном, зація емульсій масло-у-воді, таких як препарат або їхньою комбінацією. Антиген може набувати Амфіген, не здійснювалася. форми інактивованої суцільної клітини або її часВ даному винаході мікрофлюїдизація застосотини або препарату вірусу або форми антигенних вується для створення оточених лецитином крапмолекул, одержаних шляхом традиційного очилинок мінерального масла субмікронних розмірів. щення білку, генно-інженерними способами або Винахідниками було несподівано виявлено, що хімічним синтезом. мікрофлюїдизація композицій вакцин з ад'ювантом Ще в одному варіанті даний винахід забезпеу вигляді емульсії масло-у-воді, що включає суміш чує способи одержання вакцинних композицій, які лецитину і масла, не тільки покращує зовнішній містять антиген або антигени, поєднані з субміквигляд препаратів, але також підсилює імунізуваронною-емульсією масло-у-воді. льну дію препаратів. Мікрофлюїдизовані препараВ процесі виготовлення вакцинних композицій ти також характеризуються покращеним профілем за даним винаходом антиген(и) може бути поєдбезпечності. наний внутрішньо (наприклад, до мікрофлюїдизаВинахідниками було несподівано виявлено, ції) або зовнішньо (наприклад, після мікрофлюїдищо ад'ювантна активність і профіль безпечності зації) з компонентами емульсії масло-у-воді. емульсій масло-у-воді на базі масла, що не метаПереважно, антиген поєднують з компонентами болізується, можуть бути покращені шляхом мікемульсії масло-у-воді внутрішньо. рофлюїдизації. Антигени, інкорпоровані у мікрофВ іншому варіанті даний винахід забезпечує люїдизовані емульсії, є стабільними навіть, якщо вакцинні композиції, які містять мікроінкапсульоваантигени внутрішньо введені в емульсії до мікроний антиген і субмікронну емульсію масло-у-воді, флюїдизації. описану вище в даному описі, де мікроінкапсульоВідповідно, в одному варіанті даний винахід ваний антиген поєднаний з емульсією зовнішньо. забезпечує препарат субмікронної емульсії маслоТакож несподівано було виявлено, що сапонін у-воді, корисний як ад'ювант для вакцини. Субмікі стерол при поєднанні в розчині зв'язуються один ронні емульсії масло-у-воді за даним винаходом з одним з утворенням комплексів у формі спіральскладаються з масла, що не метаболізується, щоних міцел. У відповідності до даного винаходу вканайменше однієї поверхнево-активної речовини і зані спіральні міцели здійснюють імуностимулюваводного компонента, причому масло дисперговане льну дію і є особливо корисними як ад'юванти у у водному компоненті з середнім розміром крапкомпозиціях вакцин. линки масла в субмікронному інтервалі. ПереважВідповідно, даний винахід забезпечує компоним маслом, що не метаболізується, є легке мінезиції вакцин, які містять сапонін і стерол, де сапоральне масло. Переважні поверхнево-активні нін і стерол утворюють комплекси у формі спіральних міцел. Даний винахід також забезпечує речовини включають лецитин, Твін-80 (TWEEN композиції з вмістом сапоніну, стеролу та антиге80) і Спан-80 (SPAN -80). ну, де сапонін і стерол утворюють комплекси у Переважна емульсія масло-у-воді за даним формі спіральних міцел і де антиген попередньо винаходоі має рецептуру препарату Амфіген. 9 89631 10 змішаний із спіральними міцелами, але не інкорми препаратами вакцин, які містили рекомбінантпорований в них. ний антиген PauA і антиген суцільних клітин Е. coli. На Фігурі 1 зображено процес виготовлення На Фігурі 9 показані геометричні середні знасерії не мікрофлюїдизованих композицій вакцин. В чення титрів IgG для антигену суцільних клітин Е. цьому процесі різні компоненти вакцини додають в coli з Streptococcus uberis після вакцинації різними судину для додавання (зліва) і, кінець кінцем, за препаратами вакцин, які містили рекомбінантний допомогою насосу перекачують в судину для зміантиген PauA і антиген суцільних клітин Е. coli. шування, де компоненти змішуються за допомогою На Фігурі 10А і 10В показаний розподіл розміру простих механічних засобів. частинок в препараті мікрофлюїдизованого АмфіНа Фігурі 2 зображено процес виготовлення гену після виготовлення (Фігура 10А) і через 22 мікрофлюїдизованих композицій вакцин, які місмісяці після виготовлення (Фігура 10В). тять внутрішньо інкорпорований антиген. Різні Фігура 11 являє собою фотографію, зроблену компоненти вакцини додають до судини для додаза допомогою електронного мікроскопу, на якій вання і переміщують у вузол для передпоказані спіральні міцели, утворені довгими міцеемульсійного змішування для змішування за долами Квіл-А і кристалами холестерину. помогою простих механічних засобів. Далі емульФігура 12 являє собою фотографію, зроблену сію пропускають крізь мікрофлюїдизатор та збиза допомогою електронного мікроскопу, на якій рають в пост-мікрофлюїдизаційній камері. показані спіральні імуногенні комплекси, утворені На Фігурі 3 зображено розподіл розміру крапКвіл-А і холестерином на поверхні антигену БВД линок не мікрофлюїдизованої вакцини на базі претипу І. парату Амфіген, мікрофлюїдизованої вакцини на Винахідниками несподівано було виявлено, базі препарату Амфіген, а також апаратного перещо мікрофлюїдизація препаратів вакцин, які місмішування (bench blend) препарату/виготовлення тять ад'ювант у вигляді емульсії масло-у-воді, що вакцини. включає суміш лецитину і мінерального масла, не Фігура 4 демонструє відсутність розділення тільки покращує зовнішній вигляд препаратів вакфаз в мікрофлюїдизованому препараті вакцини. цин, але також підсилює імунізувальну дію препаНа Фігурі 5 зображено порівняння стабільності ратів вакцин. Мікрофлюїдизовані препарати вакантигенів, внутрішньо інкорпорованих в мікрофлюцин також характеризуються покращеним їдизований препарат вакцини на базі препарату профілем безпечності. Амфіген (А907505) і трьох контрольних, не мікроНа базі вказаних відкриттів даний винахід зафлюїдизованих препаратах вакцин на базі препабезпечує субмікронні емульсії масло-у-воді, корисрату Амфіген (А904369, А904370 та А904371). Всі ні як ад'юванти в композиціях вакцин. Також зачотири препарати вакцин зберігали при 4°С протябезпечуються способи виготовлення вказаних гом двох років. В різні періоди зберігання (0, 6, 12 і субмікронних емульсій масло-у-воді з використан24 місяці) всі чотири препарати використовували ням мікрофлюїдизатора. Крім того, даний винахід для вакцинації корів віком 3 місяці. Вакцинацію забезпечує субмікронні композиції вакцин, в яких здійснювали в дні 0 і 21 з введенням 2мл вакцини антиген поєднаний із субмікронною емульсією мата сироватку збирали через 2 тижні після другої сло-у-воді. Також забезпечені способи виготоввакцинації. Титр нейтралізуючих антитіл до вірусу лення таких композицій вакцин. Даний винахід БВД типу II визначали в кожному із зразків сироватакож забезпечує композиції вакцин, які містять тки. Дані представлені як геометричне середнє мікроінкапсульовані антигени, поєднані з субмікзначення для 5 тварин. ронною емульсією масло-у-воді, і способи виготоНа Фігурі 6 представлені визначені за методом влення таких вакцин. найменших квадратів середні значення ректальної З метою ясності розкриття, а не з метою обтемператури великої рогатої худоби до і після меження, детальний опис винаходу розділений на введення мікрофлюїдизованих і не мікрофлюїдинаступні підрозділи, які описують або ілюструють зованих вакцин. Т01: група плацебо, одна доза; деякі особливості, варіанти або застосування виТ02: група плацебо - подвійна доза; Т03: не мікнаходу. рофлюїдизований препарат - одна доза; Т04: не Субмікронні емульсії масло-у-воді мікрофлюїдизований препарат - подвійна доза; В одному варіанті даний винахід забезпечує Т05: мікрофлюїдизований препарат - одна доза; препарати субмікронних емульсій масло-у-воді, Т06: мікрофлюїдизований препарат - подвійна корисні як ад'юванти вакцин. Субмікронні емульсії доза. масло-у-воді за даним винаходом підсилюють імуНа Фігурі 7 показані виміряні за методом найногенність антигену у вакцинних композиціях, є менших квадратів середні значення обсягу реакції безпечними для введення тваринам і стабільними в місці ін'єкції, яка спостерігалася у великої рогатої в процесі зберігання. худоби після введення не мікрофлюїдизованих і Субмікронні емульсії масло-у-воді за даним мікрофлюїдизованих вакцинних препаратів. Т03: винаходом складаються з масла, яке не піддаєтьне мікрофлюїдизований препарат - одна доза; Т04: ся метаболізму, щонайменше однієї поверхневоне мікрофлюїдизований препарат - подвійна доза; активної речовини та водного компонента, причоТ05: мікрофлюїдизований препарат - одна доза; му масло дисперговане у водному компоненті із Т06: мікрофлюїдизований препарат - подвійна середнім розміром краплинок масла в субмікрондоза. ному інтервалі. На Фігурі 8 показані геометричні середні знаТермін "субмікронний" означає, що розмір крачення титрів IgG для рекомбінантного антигену плинок є меншим за 1мкм (мікрон) і середній розPauA з Streptococcus uberis після вакцинації різнимір краплинок масла є меншим за 1мкм. Переваж 11 89631 12 но середній розмір краплинок в емульсії менше активні речовини, які не зустрічаються у природі. 0,8мкм; більш переважно менше 0,5мкм; і навіть Біологічно сумісні поверхнево-активні речовини більше переважно, менше 0,4мкм або знаходиться включають фосфоліпідні сполуки або суміші фосв інтервалі приблизно 0,1-0,3мкм. фоліпідів. Переважними фосфоліпідами є фосфа"Середній розмір краплинок" визначається як тидилхоліни (лецитин), наприклад, соєвий або Середній Об'ємний Діаметр (СОД) розміру частияєчний лецитин. Лецитин може бути одержаний у нок в об'ємі розподілу розмірів частинок. СОД розвигляді суміші фосфатидів і тригліцеридів шляхом раховується шляхом помноження діаметру кожної промивання водою сирих рослинних олій та відочастинки на об'єм всіх частинок такого розміру з кремлення і сушки утворених гідратованих смол. наступною сумацією. Далі одержане число ділять Очищений продукт може бути одержаний шляхом на загальний об'єм всіх частинок. фракціонування суміші на нерозчинні в ацетоні Термін "масло, яке не піддається метаболізму" фосфоліпіди та гліколіпіди, які залишаються після в даному описі означає масла, що не можуть бути витягання тригліцеридів та рослинної олії шляхом метаболізовані організмом тварини, якій вводять промивання ацетоном. Альтернативно, лецитин емульсію. може бути одержаний з різних комерційних джеТерміни "тварина і тваринний суб'єкт" в данорел. Інші придатні фосфоліпіди включають фосму описі стосуються всіх не-гуманоїдних тварин, в фатидилгліцерин, фосфатидилінозитол, фосфатому числі, наприклад, великої рогатої худоби, тидилсерин, фосфатидинову кислоту, кардіоліпін і овець та свиней. фосфатидилетаноламін. Фосфоліпіди можуть бути Масла, які не піддаються метаболізму, придавиділені з природних джерел або синтезовані за тні для використання в емульсіях за даним винатрадиційними методиками. ходом, включають алкани, алкени, алкіни та відпоСинтетичні поверхнево-активні речовини, які відні кислоти і спирти, їхні ефіри та естери та не зустрічаються в природі, придатні для викориссуміші вказаних компонентів. Переважно, окремі тання в субмікронних емульсіях за даним винахосполуки в маслі являють собою легкі вуглеводневі дом, включають неіонні поверхнево-активні речосполуки, тобто, компоненти, які включають 6-30 вини на базі сорбітану, тобто, поверхнево-активні атомів вуглецю. Масло може бути одержане синречовини на базі сорбітану, заміщеного жирними тетичним шляхом або очищене з продуктів нафтокислотами (комерційно доступні під назвою Спан переробки. Переважні масла, які не піддаються (SPAN ) або Арлацел (ARLACEL )), естери жирметаболізму, для використання в емульсіях за них кислот і поліетоксильованого сорбіту (Твін, даним винаходом включають, наприклад, мінераTWEEN ), естери поліетиленгліколю та жирних льне масло, парафінове масло і циклопарафіни. кислот з таких джерел, як рицинова олія Термін "мінеральне масло" означає суміш рід(EMULFOR), поліетоксильовані жирні кислоти (наких вуглеводнів, одержаних з нафти за допомогою приклад, стеаринова кислота, доступна під назвою техніки перегонки. Термін є синонімічним до терSIMULSOL М-53), поліетоксильований полімер ізоміну "рідкий парафін", "рідкий вазелін" та "біле октилфенолу/формальдегіду (TYLOXAPOL), поліомінеральне масло". Термін також охоплює "рідке ксиетиленові ефіри жирних спиртів (BRIJ ), нонмінеральне масло", тобто масло, яке одержують фенілові ефіри поліоксиетилену (TRITON N), ізопростою перегонкою вазеліну, але яке має дещо октилфенілові ефіри поліоксиетилену (TRITON меншу питому вагу, ніж біле мінеральне масло. X). Переважні синтетичні поверхнево-активні реДив., наприклад Remington's Pharmaceutical човини являють собою поверхнево-активні речоth Sciences, 18 Edition (Easton, Pa.: Mack Publishing вини, присутні на ринку під назвою SPAN та Company, 1990, стор. 788 та 1323). Мінеральне TWEEN . масло може бути отримане з різних комерційних Переважні поверхнево-активні речовини для джерел, наприклад J. Т. Baker (Phillipsburg, PA), використання в емульсіях масло-у-воді за даним USB Corporation (Cleveland, OH). винаходом, являють собою, не обмежуючись ниПереважне мінеральне масло являє собою леми, лецитин, Твін-80 і Спан-80. гке мінеральне масло, комерційно доступне під Загалом кажучи, поверхнево-активна речовиназвою Дракеол (DRAKEOL ). на або комбінація поверхнево-активних речовин, Типово, масляний компонент субмікронних якщо використовують дві або більше поверхневоемульсій за даним винаходом присутній в кількості активних речовин, присутня в емульсії в кількості від 1% до 50% по об'єму; переважно, в кількості від 0,01% до 10% по об'єму, переважно, від 0,1% від 10% до 45%; більш переважно, в кількості від до 6,0%, більш переважно, від 0,2% до 5,0%. 20% до 40%. Водний компонент включає безперервну фазу Емульсії масло-у-воді за даним винаходом тиемульсії і може являти собою воду, буферизовапово включають щонайменше одну (тобто, одну ний сольовий розчин або будь-який інший придатабо більше) поверхнево-активних речовин. Поверний водний розчин. хнево-активні речовини являють собою емульгаЕмульсії масло-у-воді з даним винаходом мотори, причому в даному описі зазначені терміни жуть включати додаткові компоненти, які є придазастосовуються взаємозамінним чином і є агентатними і бажаними, в тому числі консерванти, осми, які стабілізують поверхню краплинок масла та мотичні агенти, біоадгезивні молекули та підтримують бажаний розмір краплинок масла. імуностимулювальні молекули. Поверхнево-активні речовини, придатні для Вважається, що біоадгезивні молекули можуть використання в емульсіях за даним винаходом, підсилювати доставку і приєднання антигенів до включають природні біологічно сумісні поверхнецільової поверхні слизової оболонки або крізь неї, во-активні речовини і синтетичні поверхневозабезпечуючи імунітет слизової оболонки. Прик 13 89631 14 лади придатних біоадгезивних молекул включають явив гетерогенну суміш тісно споріднених сапонікислотні полімери, які не зустрічаються в природі, нів і призвів до відкриття QS21, який був потужний такі як поліакрилова кислота і поліметакрилова ад'ювантом із зниженою або мінімальною токсичністю. Kensil C.R. et al., "Separation and кислота (наприклад, CARBOPOL CARBOMER); characterization of saponins with adjuvant activity кислотні синтетично модифіковані природні поліfrom Quillaja saponaria Molina cortex," J. Immunol. мери, такі як карбоксиметилцелюлоза; нейтральні 146: 431-437, 1991. На відміну від більшості інших синтетично модифіковані природні полімери, такі імуностимуляторів, QS21 є водорозчинним і може як (гідроксипропіл)метилцелюлоза; основні полівикористовуватися у вакцинах з препаратами мери, які несуть аміногрупи, такі як хітозан; кислоемульсійного типу або без них. Показано, що QS21 тні полімери, одержані з природних джерел, такі як викликає реакцію типу Th1 у мишей, стимулюючи альгінова кислота, гіалуронова кислота, пектин, вироблення антитіл lgG2a та lgG2b, а також індутрагакантова камедь і камедь карайї; а також нейкованих антиген-специфічних CD8+CTL (МНС клас тральні полімери, які не зустрічаються в природі, І) у відповідь на субодиничні антигени. Клінічні такі як полівініловий спирт; або комбінації вказаних дослідження за участю людей показали його ад'юкомпонентів. вантні властивості з прийнятним токсикологічним Фраза "імуностимулювальні молекули" в дапрофілем. Kensil, C.R. і інші, "Structural and ному описі означає такі молекули, які підсилюють imunological characterization of the vaccine adjuvant захисну імунну реакцію, спричинену антигенним QS-21. In Vaccine Design: the subunit and Adjvuant компонентом у вакцинних композиціях. Придатні Approach," Eds. Powell, M.F. and Newman, M. J. імуностимулювальні матеріали включають компоPlenum Publishing Corporation, New York. 1995, pp. ненти стінки бактеріальної клітини, наприклад, 525-541. похідні N-ацетил-мураміл-L-аланіл-D-ізоглутаміну, Патент США 6,080,725 розкриває способи витакі як мурабітид, треоніл-MDP і мурамілу трипепготовлення та застосування сапонін-ліпофільного тид; сапонінові глікозиди та їхні похідні, наприклад, кон'югату. У вказаному сапонін-ліпофільному кон'Квіл-А, QS 21 і GPI-0100; холестерин; і четвертинні югаті ліпофільний залишок, такий як ліпід, жирна амонієві сполуки, наприклад, диметилдіоктадецикислота, поліетиленгліколь або терпен ковалентно ламонію бромід (ДДА) та N,N-дюктадецил-N,N-бicприєднаний до не-ацильованого або деацильова(2-гідроксиетил)-пропандіамін ("авридин"). ного тритерпенового сапоніну через карбоксильну Сапоніни являють собою глікозидні сполуки, групу, присутню на 3-О-глюкуроновій кислоті триякі утворюються як вторинні метаболіти в різноматерпенового сапоніну. Приєднання ліпофільного нітних видах рослин. Хімічна структура сапонінів залишку до 3-О-глюкуронової кислоти сапоніну, обумовлює широкий спектр фармакологічної та такого як деацилсапонін Quillaja, люциозид Ρ або біологічної активності, в тому числі деякі потужні сапонін з Gypsophila saponaria та Acanthophyllum та ефективні види імунологічної активності. підсилює їхні ад'ювантні властивості по відношенЗ структурної точки зору сапоніни складаються ню до гуморального та клітинно-опосередкованого з аглікона, приєднаного до одного або більше ланімунітету. Крім того, приєднання ліпофільного цюгів цукрів. Сапоніни можуть бути класифіковані фрагмента до залишку 3-О-глюкуронової кислоти у відповідності до складу аглікона: тритерпенові неацильованого або деацильованого сапоніну дає глікозиди, стероїдні глікозиди і стероїдносапоніновий аналог, який краще піддається очиапкалоїдні глікозиди. щенню, є менш токсичним, більш стабільним з Сапонін може бути виділений з кори Quillaja хімічної точки зору і володіє рівними або більш saponaria. Довгий час сапонін був відомий як імувираженими ад'ювантними властивостями, ніж ностимулятор. Dalsgaard, K., "Evaluation of its початковий сапонін. adjuvant activity with a special reference to the GPI-0100 являє собою сапонін-ліпофільний application in the vaccination of cattle against footкон'югат, описаний в Патенті США 6,080,725. GPIand-mouth disease", Acta. Vet. Scand. 69: 1-40, 0100 утворюють шляхом додавання аліфатичного 1978. Сирі екстракти рослин, які містять сапонін, аміну до деацилсапоніну через карбоксильну групу підсилюють потужність вакцин проти захворюванглюкуронової кислоти. ня на ящур. Однак, сири екстракти при застосуЧетвертинні амонієві сполуки. Численні аліфаванні у вакцинах супроводжувалися небажаними тичні азотисті основи запропоновані до застосупобічними ефектами. Отже, Dalsgaard частково вання як імунологічні ад'юванти, в тому числі аміочищував ад'ювантний активний компонент від ни, четвертинні амонієві сполуки, гуанідини, сапоніну шляхом діалізу, іонного обміну та гельбензамідини і тіоуронії. Конкретно такі сполуки фільтраційною хроматографією. Dalsgaard, К. et включають диметилдіоктадециламонію бромід al., "Saponin adjuvants III. Isolation of a substance (ДДА) і N,N-діоктадецил-N,N-бic-(2from Quillaja saponaria Morina with adjuvant activity гідроксиетил)пропандіамін ("авридин"). in foot-and-mouth disease vaccines", Arch. Gesamte. Патент США 5,951,988 розкриває ад'ювантний Virusforsch. 44: 243-254, 1974. Ад'ювантний активпрепарат з вмістом четвертинних амонієвих солей, ний компонент, очищений таким способом, відотаких як ДДА, в поєднанні з масляним компоненмий як Квіл-А ("Quil А"). В перерахунку на масу том. Такий препарат є корисним в поєднанні з віКвіл-А демонстрував підвищену потужність та дедомими імунологічними речовинами, наприклад, монстрували зменшення місцевих реакцій в поріввірусними або бактеріальними антигенами у вакнянні з сирим сапоніном. Квіл-А широко застосовуцинній композиції, з метою підсилення імуногенної ється у ветеринарних вакцинах. відповіді. Композиція також є корисною без інкорПодальший аналіз Квіл-А за допомогою високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) ви 15 89631 16 порованого антигену, як неспецифічний імуностилежності від типу поверхнево-активної речовини, мулювальний препарат. співвідношення поверхнево-активна речовиВ Патенті США 4,310,550 описано застосуванна/масло, робочого тиску, температури і т. п. Спеня Ν,Ν-вищого алкіл-N,N'-біс(2-гідроксиетил)ціаліст в даній галузі може визначити бажану компропандіаміну та Ν,Ν-вищих алкілбінацію зазначених параметрів для одержання ксилілендіамінів, поєднаних з жировою або ліпідемульсій з бажаним розміром краплинок без зайною емульсією як ад'ювантом вакцини. Спосіб вивого експериментування. Краплинки емульсії за кликання або підсилення імуногенної реакції на даним винаходом мають діаметр менше 1мкм, антиген у людини або тварини шляхом парентепереважно, з середнім розміром краплинки менше рального введення ад'ювантного препарату опи0,8мкм і, більш переважно, з середнім розміром сано в Патенті США 4,310,550. краплинки менше 0,5мкм, і навіть більш переважВ переважному варіанті даний винахід забезно, з середнім розміром краплинки менше 0,3мкм. печує субмікронну емульсію масло-у-воді, корисну В переважному варіанті даного винаходу масяк ад'ювант вакцини, яка складається з препарату ляний розчин лецитину Дракеол, який є комерційАмфіген з краплинками розміром менше 1мкм і но доступним від Hydronics (Lincoln, NE) і містить середнім розміром краплинок приблизно 0,25мкм. 25% лецитину в легкому мінеральному маслі, поТермін "препарат Амфіген" в даному описі єднують і змішують з сольовим розчином, а також означає розчин, утворений шляхом змішування поверхнево-активними речовинами Твін-80 і Спанлецитиново-масляного розчину Дракеол 80 з утворенням "розчину Амфіген" або "препарату Амфіген". Далі розчин Амфіген емульгують за до(DRAKEOL ) (Hydronics, Lincoln, NE) з сольовим помогою емульгатора Ross (Hauppage, NY розчином в присутності Твіну-80 і Спану-80. Типовий препарат Амфіген містить 40% легкого міне11788) при швидкості приблизно 3400об./хв для рального масла (об./об.), приблизно 25% (мас./об.) утворення емульсії масло-у-воді. Далі емульсію лецитину, приблизно 0,18% Твіну 80 (об./об.) і пропускають один раз крізь мікрофлюїдизатор з приблизно 0,08% Спану 80 (об./об.). робочими значеннями тиску приблизно Способи виготовлення субмікронних емульсій 4500±500фунт/дюйм2. Розмір краплинок в мікрофмасло-у-воді люїдизованій емульсії масло-у-воді є меншим за В іншому варіанті даний винахід забезпечує 1мкм, із середнім розміром краплинок приблизно способи виготовлення описаних вище субмікрон0,25мкм. них емульсій масло-у-воді. Вакцинні композиції з вмістом антигенів, ввеУ відповідності до даного винаходу різні комдених в субмікронні емульсії масло-у-воді поненти емульсії, в тому числі масло, одна або В іншому варіанті даний винахід забезпечує більше поверхнево-активних речовин, водний вакцинні композиції, які містять антиген(и) і описакомпонент та будь-який інший компонент, придатну вище субмікронну емульсію масло-у-воді. Вканий для використання в емульсії, поєднують і змізані вакцинні композиції характеризуються підсишують. леною імуногенною дією та покращеним зовнішнім Утворену суміш піддають емульгації, типово виглядом (наприклад, після тривалого періоду шляхом пропускання один або більше разів через зберігання не відбувається розділення фаз). Крім один або більше гомогенізаторів або емульгаторів того, вакцинні композиції за даним винаходом є з утворенням емульсії масло-у-воді, яка має однобезпечними при введенні тваринам. рідний зовнішній вигляд та середній розмір крапУ відповідності до даного винаходу антиген линок приблизно 0,5мкм. Для цієї мети може бути може бути поєднаний з емульсією зовнішньо або, використаний будь-який присутній на ринку гомопереважно, внутрішньо. Термін "внутрішньо" стогенізатор або емульгатор, наприклад, емульгатор сується процесу, коли антиген поєднують з компоRoss (Hauppauge, NY), гомогенізатор Gaulin нентами емульсії до стадії мікрофлюїдизації. Тер(Everett, MA). мін "зовнішньо" стосується процесу, коли антиген Утворену таким чином емульсію далі піддають додають до емульсії після мікрофлюїдизації емумікрофлюїдизації для доведення розміру краплильсії. Зовнішньо доданий антиген може бути вільнок до субмікронних значень. Мікрофлюїдизація ним антигеном або він може бути інкапсульований може бути здійснена шляхом використання комеру мікрочастинки, як буде додатково описано нижційного мікрофлюїдизатора, такого як модель ноче. мер 11ΟΥ, доступна від Microfluidics, Newton, Термін "антиген" в даному описі означає будьMass; модель Gaulin 30CD (Gaulin, Inc., Everett, яку молекулу, сполуку або композицію, яка є імуMASS); і Rainnia Minilab тип 8,30Н (Micro Atomizer ногенною для тварини і включена у вакцинну комFood and Dairy, Inc., Hudson, Wis.). Вказані мікропозицію для викликання захисної імунної реакції у флюїдизатори здійснюють свою дію, примушуючи тварини, які вводять вакцинну композицію. рідину проходити крізь малі отвори під високим Термін "імуногенний", якщо він використовутиском, таким чином, що два струменя рідини взається в зв'язку з антигеном, стосується здатності ємодіють при високих швидкостях в камері взаєантигену викликає імунну реакцію проти антигену у модії з утворенням емульсії з краплинками субміктварини. Імунна реакція може являти собою кліронного розміру. тинну імунну реакцію, опосередковану, головним Розмір краплинок може бути визначений за чином, цитотоксичними Т-клітинами, або гуморадопомогою різноманітних способів, відомих з рівня льну імунну реакцію, опосередковану, головним техніки, таких як лазерна дифракція, шляхом вичином, хелперними Т-клітинами, що, в свою чергу, користання присутніх на ринку інструментів для активує В-клітини і приводить до вироблення анвизначення розміру. Розмір може варіювати в затитіл. 17 89631 18 "Захисна імунна реакція" визначається як активних речовин, якщо використовуються дві або будь-яка імунна реакція, реалізована за допомобільше поверхнево-активних речовин, присутня в гою антитіл або опосередкована клітинами імунна кінцевому об'ємі вакцинної композиції в кількості реакція, або обидві, які виникають у тварини та від 0,1% до 20% (об.), переважно, від 0,15% до запобігають або значною мірою зменшують зустрі10%, більш переважно, від 0,2% до 6,0%. чальність або усувають або значною мірою зменНа додаток до антигену(ів) та емульсії маслошують силу, або значною мірою сповільнюють у-воді, вакцинна композиція може включати інші швидкість прогресу розладу або захворювання, компоненти, які є придатними і бажаними, такі як спричиненого антигеном або патогеном, який місконсерванти, осмотичні агенти, біоадгезивні молетить антиген. кули та імуностимулювальні молекули, наприклад, Антигени, які можуть бути включені у вакцинну Квіл-А, холестерин, GPI-0100, диметилдіоктадецикомпозицію за даним винаходом, включають антиламонію бромід (ДДА), як описано вище в зв'язку з гені, одержані з патогенних бактерій, таких як емульсією масло-у-воді. Mycoplasma hyopneumoniae, Haemophilus somnus, Вакцинні композиції за даним винаходом таHaemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, кож можуть включати придатний для ветеринарії Actinobacillus pleuropneumonie, Pasteurella носій. Термін "придатний для ветеринарії носій" multocida, Manheimia hemolytica, Mycoplasma bovis, включає будь-який або всі розчинники, дисперсійMycoplasma galanacieum, Mycobacterium bovis, не середовище, покриття, ад'юванти, стабілізуючі Mycobacterium paratuberculosis, види Clostridial., агенти, розбавлювачі, консерванти, антибактеріаStreptococcus uberis, Streptococcus suis, льні та протигрибкові агенти, ізотонічні агенти, Staphylococcus aureus, Erysipelothrix rhusopathiae, агенти, що затримують абсорбцію і т. п. Розбаввиди Campylobacter, Fusobacterium necrophorum, лювачі можуть включати води, сольовий розчин, Escherichia coli, сероваріанти Salmonella enterica, декстрозу, етанол, гліцерин і т. п. Ізотонічні агенти види Leptospira; патогенних грибів, таких як можуть включати, серед іншого, натрію хлорид, Candida; найпростіших, таких як Cryptospohdium декстрозу, маніт, сорбіт і лактозу. Стабілізатори, parvum, Neospora canium, Toxoplasma gondii, види серед іншого, включають альбумін. Eimeria; гельмінтів, таких як Ostertagia, Cooperia, В переважному варіанті даний винахід забезHaemonchus, Fasciola, у формі інактивованого печує вакцинну композицію, яка включає щонайпрепарату цільної клітини або її частин, або у фоменше один з антигенів БВВД типу І або БВВД рмі антигенних молекул, одержаних шляхом тратипу II, введений внутрішньо в емульсію масло-удиційного очищення білка, генно-інженерних технік воді, яка містить краплинки розміром менше 1мкм, або хімічного синтезу. Додаткові антигени вклюпереважно із середнім розміром краплинок менше чають патогенні віруси, такі як бичачі герпесвіруси0,8мкм, більш переважно, менше 0,5мкм, і навіть 1,3,6, бичачий вірус вірусної діареї (БВВД) типу 1 і більш переважно, з середнім розміром краплинки 2, бичачий вірус парагрипу, бичачий респіраторприблизно 0,5мкм. Антиген БВВД типу І та/або II ний синцітіальний вірус, бичачий вірус лейкозу, переважно знаходиться у формі препарату інактивірус чуми великої рогатоїхудоби, вірус ящуру, вованого вірусу. Субмікронна емульсія масло-усказу, вірус свиної гарячки, вірус африканської воді переважно складається з препарату Амфіген свиної гарячки, свиний парвовірус, вірус PRRS, (тобто, препарату, який містить легке мінеральне свиний цирковірус, вірус грипу, вірус везикулярної масло, лецитин, Твін-80 і Спан-80). Вакцинна комхвороби свиней, вірус TECHEN гарячки, вірус псепозиція також переважно включає Квіл-А, холесвдосказу, у формі інактивованого препарату цільтерин і тимеросал. ного вірусу, клітини або їхніх частин, або у формі В іншому переважному варіанті даний винахід антигенних молекул, одержаних шляхом традиційзабезпечує вакцинну композицію, яка включає анного очищення білка, генно-інженерних технік або тиген Leptospira і щонайменше один з антигенів хімічного синтезу. БВВД типу І або типу II в емульсії масло-у-воді. Кількість антигену повинна бути такою, щоб Антигени, переважно у формі препарату інактивоантиген, який в комбінації з емульсією масло-уваних клітин або вірусу, введені внутрішньо в емуводі, ефективно викликає захисну імунну реакцію у льсію масло-у-воді, яка містить краплинки розмітварини. Точна ефективна кількість антигену заром менше 1мкм, переважно із середнім розміром лежить від природи, активності чистоти антигену і краплинок менше 0,8мкм, більш переважно, менможе бути визначена спеціалістом в даній галузі. ше 0,5мкм, і, навіть більш переважно, з середнім Присутня у вакцинних композиціях кількість розміром приблизно 0,5мкм. Субмікронна емульсія емульсії масло-у-воді повинна бути достатньою масло-у-воді переважно складається з препарату для потенціювання імуногенності антигену(ів) у Амфіген (тобто, препарату, який містить легке мівакцинних композиціях. Якщо це є доцільним та неральне масло, лецитин, Твін-80 і Спан-80). Пепридатним, додаткові кількості поверхневореважно вакцинна композиція також включає одну активної речовини або речовин можуть бути додаабо більше імуностимулювальних молекул, вибрані до вакцинної композиції на додаток до поверхних з Квіл-А, холестерину, ДДА, GPI-100 та алюмінево-активної речовини або речовин, що містяться нію гідроксиду (АІОН). в емульсії масло-у-воді. Загалом кажучи, масляВ ще одному переважному варіанті даний виний компонент присутній в кінцевому об'ємі вакнахід забезпечує вакцинну композицію, яка вклюцинної композиції в кількості від 1,0% до 20% (об.); чає щонайменше один бактеріальний антиген, переважно, в кількості від 1,0% до 10%; більш пенаприклад, рекомбінантий білок Streptococcus реважно, в кількості від 2,0% до 5,0%. Поверхневоuberis PauA або препарат клітин Е. coli, або комбіактивна речовина або комбінація поверхневонацію обох компонентів в емульсії масло-у-воді. 19 89631 20 Антиген(и) поєднані внутрішньо з емульсією масвикористання присутніх на ринку інструментів для ло-у-воді, яка містить краплинки розміром менше визначення розміру. Розмір може варіювати в за1мкм, переважно із середнім розміром краплинок лежності від типу поверхнево-активної речовини, менше 0,8мкм, більш переважно, менше 0,5мкм, і співвідношення поверхнево-активна речовинавіть більш переважно, з середнім розміром прина/масло, робочого тиску, температури і т. п. Спеблизно 0,25мкм. Субмікронна емульсія масло-уціаліст в даній галузі може визначити бажану комводі переважно складається з препарату Амфіген бінацію зазначених параметрів для одержання (тобто, препарату, який містить легке мінеральне емульсій з бажаним розміром краплинок. Краплинмасло, лецитин, Твін-80 і Спан-80). Переважно ки емульсії за даним винаходом мають діаметр вакцинна композиція також включає одну або біменше 1мкм, переважно з середнім розміром кральше імуностимулюючих молекул, вибраних з плинки менше 0,8мкм, більш переважно, з середКвіл-А, ДДА та GPI-100. нім розміром краплинки менше 0,5мкм, і навіть Вакцинні композиції за даним винаходом мобільш переважно, з середнім розміром краплинки жуть вводитися тварині відомими способами, в приблизно від 0,1 до 0,3мкм. тому числі перорально, інтраназально, через слиВ переважному варіанті даного винаходу масзову оболонку, місцево, трансдермально і паренляний розчин лецитину Дракеол, який містить 25% терально (наприклад, внутрішньовенно, внутрішлецитину в легкому мінеральному маслі, поєднуньочеревинно, підшкірно або внутрішньом'язово). ють і змішують з поверхнево-активними речовиВведення можна здійснювати з використанням нами Твін-80 і Спан-80, а також з сольовим розчикомбінації способів, наприклад, введення першої ном з утворенням суміші, яка містить 40 % легкого дози парентеральним шляхом з подальшим ввемінерального масла, лецитин, 0,18% Твіну-80 і денням крізь слизову оболонку. 0,08% Спану-80. Далі суміш емульгують за допоСпособи виготовлення вакцинних композицій могою емульгатора Ross (Hauppage, NY 11788) В іншому варіанті даний винахід забезпечує приблизно при швидкості 3400об./хв для утворенспособи виготовлення вакцинних композицій, які ня емульсійного продукту, який також називають містять антиген або антигени та субмікронну ему"препарат Амфіген" або "розчин Амфіген". Далі льсію масло-у-воді. бажаний антиген(и) поєднують з розчином АмфіПри виготовленні вакцинних композицій за даген та будь-якими іншими придатними компоненним винаходом антиген(и) може бути поєднаний тами (наприклад, імуностимулювальні молекули) внутрішньо або зовнішньо з компонентами емульза допомогою емульгатора, наприклад, гомогенісії масло-у-воді. Переважно, антиген поєднують з затор Ross, з утворенням емульсії масло-у-воді, компонентами емульсії масло-у-воді внутрішньо. яка містить антиген(и). Таку емульсію один раз Антиген може бути поєднаний з різними компропускають крізь мікрофлюїдизатор При робочих понентами емульсії, в тому числі маслом, однією значеннях тиску приблизно 10000±500фунт/дюйм2. або більше поверхнево-активних речовин, водним Розмір краплинок в мікрофлюїдизованій емульсії компонентом та будь-яким іншим придатним коммасло-у-воді є меншим за 1мкм, із середнім розміпонентом, з утворенням суміші. Суміш піддають ром краплинок приблизно 0,25мкм. процесу первинного змішування, типово пропусВ іншому переважному варіанті перед поєдкаючи один або більше разів крізь один або більнанням емульсії масло-у-воді (наприклад, препаше гомогенізаторів або емульгаторів, з утворенрату Амфіген) з бажаним антигеном(ами), антиням емульсії масло-у-воді, яка містить антиген. ген(и) поєднують з сапоніновим глікозидом, Для цієї мети може бути використаний будь-який наприкггадт Квіл-А, з утворенням суміші. Суміш присутній на ринку гомогенізатор або емульгатор, антиген(и)-сапонін піддають гомогенізації, напринаприклад, емульгатор Ross (Hauppauge, NY), клад, в судині для гомогенізації. Далі до гомогенігомогенізатор Gaulin (Everett, MA) або Microfiuidics зованої суміші антиген(и)-сапонін додають стерол, (Newton, MA). Альтернативно, різні компоненти наприклад, холестерин. Після цього суміш, яка ад'ювантної емульсії, в тому числі масло, одну або містить антиген(и), сапонін і стерол піддають побільше поверхнево-активних речовин та водний дальшій гомогенізації. Гомогенізовану суміш антикомпонент можуть бути спочатку поєднані з утвоген(и)-сапонін далі поєднують з емульсією маслоренням емульсії масло-у-воді з використанням у-воді (наприклад, препарат Амфіген) за допомогомогенізатора або емульгатора; далі до одержагою гомогенізатора, наприклад. Гомогенізовану ної емульсії додають антиген. Середній розмір емульсію масло-у-воді, яка містить антиген(и), краплинок емульсії масло-у-воді після первинного сапонін і стерол, далі піддають гомогенізації в змішування становить приблизно 1,0-1,2 мікрон. умовах високого тиску, наприклад, мікрофлюїдиДалі емульсію, яка містить антиген, піддають зації. мікрофлюїдизації для доведення розміру краплиВакцинні композиції, які містять мікроінкапсунок до субмікронного. Мікрофлюїдизація може льовані антигени у субмікронній емульсії масло-уздійснюватися шляхом використання комерційного воді та способи їх виготовлення мікрофлюїдизатора, такого як модель номер Ще в одному варіанті даний винахід забезпе11OΥ, доступна від Microfluidics, Newton, Mass; чує вакцинні композиції, які містять антиген, інкапмодель Gaulin 30CD (Gaulin, Inc., Everett, MASS); сульований в мікрочастинки (або "мікроінкапсута Rainnie Minilab Type 8.30H (Micro AtomizerFoodльований антиген"), де мікроінкапсульований anef Dairy, Inc., Hudson, Wis.). антиген зовнішньо введений в субмікронну емульРозмір краплинок може бути визначений за сію масло-у-воді, описану вище. допомогою різноманітних способів, відомих з рівня Способи абсорбування або захоплення антитехніки, наприклад, лазерна дифракція, шляхом генів конкретними носіями відомі з рівня техніки. 21 89631 22 Див., наприклад, Pharmaceutical Particulate Комплекси, утворені сапоніном і стеролом Carriers: Therapeutic Applications (Justin Hanes, В одному варіанті даний винахід забезпечує Masatoshi Chiba and Robert Langer. Polymer композиції з вмістом сапоніну і стеролу, причому microspheres for vaccine delivery. In: Vaccine design. сапонін і стерол утворюють комплекси у формі The subunit and adjuvant approach. Eds. Michael F. спіральних міцел. У відповідності до даного винаPowell and Mark J. Newman, 1995 Plenum Press, ходу вказані комплекси здійснюють імуностимулюNew York and London). Конкретні носії можуть вальну дію. представляти множинні копії вибраного антигену "Імуностимулювальний" означає, що комплекімунній системі тваринного суб'єкта та сприяти си можуть підсилювати імунну реакцію, викликану захопленню і утриманню антигенів в місцевих ліантигенним компонентом, або що комплекси момфатичних вузлах. Частинки можуть бути фагоцижуть викликати імунну реакцію незалежно від товані макрофагами і можуть підсилювати предокремого антигенного компонента. ставлення антигену через вивільнення цитокіну. У відповідності до даного винаходу переважКонкретні носії також описані в рівні техніки і вклюний сапонін для використання в композиції за дачають, наприклад, одержані з поліметилметакриним винаходом являє собою Квіл-А. латних полімерів, а також одержані з поПереважні стероли для використання в ад'юлі(лактидів) і полі(лактид-спів-глікозидів), відомі як вантних композиціях за даним винаходом включаПЛГ. Поліметилметакрилатні полімери не піддають бета-сітостерол, стигмастерол, ергостерол, ються біодеградації, хоча частинки ПЛГ можуть ергокальциферол і холестерин, Вказані стероли біодеградувати шляхом випадкового недобре відомі з рівня техніки, наприклад, холестеth ферментного гідролізу естерних зв'язків до молочрин розкритий в Merck Index, 11 Edn. page 341, як них та гліколевих кислот, які виводяться нормальприродний стерол, виявлений у тваринному жирі. ними метаболічними шляхами. Найбільш переважно стерол являє собою холесБіодеградуючі мікросфери також використовутерин. валися для досягнення контрольованого вивільСпіввідношення сапонін: стерол у композиції нення вакцин. Наприклад, може бути досягнуте типово становить порядку від 1:100 до 5:1 (мас.). безперервне вивільнення антигену протягом поПереважно, співвідношення становить 1:1. довженого періоду часу. В залежності від молекуВ іншому варіанті даний винахід забезпечує лярної маси полімеру і співвідношення молочна вакцинні композиції з вмістом сапоніну, стеролу та кислота/гліколева кислота в полімері, полімер антигену, причому сапонін і стерол утворюють ПЛГА (PLGA) може мати швидкість гідролізу від комплекси у формі спіральних міцел та антиген кількох днів або тижнів до кількох місяців або ропопередньо змішаний із спіральними міцелами, ків. Повільне, контрольоване вивільнення може але не інкорпорований в них. приводити до утворення високого рівня антитіл, Нижче наведені приклади конкретних варіантів подібного до того, який утворюється в результаті для здійснення даного винаходу. Приклади навемножинних ін'єкцій. Альтернативно, може бути дені виключно з метою ілюстрування і в будьдосягнуте пульсуюче вивільнення антигенів вакякому разі не призначені обмежувати межі даного цини шляхом вибору полімерів з різною швидкістю винаходу. гідролізу. Швидкість гідролізу полімеру типово заПриклад 1 лежить від молекулярної маси полімеру і співвідВиготовлення препарату Амфіген ношення молочна кислота/гліколева кислота в Препарат Амфіген виготовляють шляхом двополімері. Мікрочастинки, виготовлені з двох або стадійного процесу. На першій стадії 80л розчину більше різних полімерів з різною швидкістю вивілецитину в маслі Дракеол, 116л розчину правцельнення антигену, забезпечують пульсуюче вивівого анатоксину в сольовому розчині, 1,2л Спанульнення антигенів та імітують багатодозові режи80 і 2,8л Твіну-80 змішують та емульгують з викоми вакцинації. ристанням емульгатора Ross. Масляний розчин У відповідності до даного винаходу, антиген, в лецитину Дракеол містить 25% соєвого лецитину і тому числі будь-який з описаних вище, може абсо75% мінерального масла. Емульгований продукт рбуватися конкретним полімерним носієм, перерециркулюють крізь емульгатор Ross мінімум до 5 важно полімером ПЛГ, з використанням будь-якої об'ємів або протягом як мінімум 10хв. Емульговаметодики, відомої з рівня техніки (такої, як предний продукт зберігають при 2-7°С протягом максиставлена в Прикладі 17), з утворенням препарату мум 24год до подальшої обробки. Емульсію з танмікроінкапсульованого антигену. Препарат мікроінка емульгатора Ross переносять до капсульованого антигену далі змішують з субмікгомогенізатора Gaulin і гомогенізують протягом ронною емульсією масло-у-воді, яка була описана 20хв при тиску 4500фунт/дюйм2. Одержаний 40% вище, та диспергують в ній, з утворенням вакцинрозчин лецитину в маслі Дракеол (далі має назву ної композиції. "Препарат Амфіген" або "розчин Амфіген") після В переважному варіанті даний винахід забезцього розливають в стерильні карбоксиполіпропіпечує вакцинну композицію, яка містить антиген, ленові контейнери. Розливання здійснюють за інкапсульований в полімер ПЛГ, причому мікроіндопомогою розливної кришки класу 100, розташокапсульований антиген зовнішньо диспергують у ваного в приміщенні з контрольованим середовимікрофлюїдизованій емульсії масло-у-воді, яка щем класу 10000. Контейнери зберігають при 2складається з легкого мінерального масла, леци7°С. Препарат Амфіген використовують в експетину, Твіну-80, Спану-80 і сольового розчину та риментах, описаних нижче, якщо не вказано інше. містить краплинки із середнім розміром менше Приклад 2 1,0мкм. 23 89631 24 Первинне змішування шляхом гомогенізації пропускають крізь мікрофлюїдизатор один раз і вакцини БВД перемішуванням з обдуванням гарязбирають в пост-мікрофлюїдизаційній камері. чим повітрям Одержаний препарат розділяють на аліквоти дози Апарат, який використовують для вказаного по 2мл і він представляє собою мікрофлюїдизовапроцесу гомогенізації, показано на Фігурах 1. З ну БВД вакцину на базі препаратуи Амфіген. використанням асептичної техніки або парових Приклад 4 хрестоподібних клапанів пляшку, яка містить антиВиготовлення вакцинної композиції шляхом ген БВД типу І (препарат інактивованого вірусу апаратного перемішування (bench blend) БВД типу І) приєднують до бічного порту для пляПрепарат Амфіген, виготовлений, як описано в шок на судині для змішування. Після закінчення Прикладі 1, розбавляють до 2,5% додаванням БВД переміщення потрібного об'єму антигену БВД типу антигенів та наповнювача. Одержаний розчин пеІ пляшку БВД типу І замінюють на пляшку, яка місремішують на апараті з використанням мішалки тить препарат інактивованого вірусу БВД типу II замість гомогенізатора. Склад кінцевого препара(препарат інактивованого вірусу БВД типу II). Після ту: антигени БВД типу І і типу II, 2,5% препарату закінчення переміщення необхідної кількості преАмфіген (який містить масло, лецитин, Спан і Твін, парату інактивованого вірусу БВД типу II гомогеніяк описано в Прикладі 1) і сольовий розчин. Твінзатор Ross приєднують до переносної судини і 80 і Спан-80 присутні в кінцевому препараті вакципочинають рециркуляцію при максимальній швидни в концентрації 0,18% і 0,08% (об.), відповідно. кості (3300об./хв). Підтримують перемішування Приклад 5 вмісту судини на середній швидкості. Порівняння розподілу розміру краплинок у не З використанням асептичної техніки або паромікрофлюїдизованому і мікрофлюїдизованому вих перехресних клапанів парових хрестоподібних препаратах вакцини на базі препарату Амфіген клапанів пляшку, яка містить Квіл-А з концентраціНе-мікрофлюїдизовану вакцину на базі препаєю 50мг/мл, приєднують до порту лінії гомогенізарату Амфіген виготовляють, як описано в Прикладі тора для пляшок на судині для змішування. Необ2, мікрофлюїдизовану вакцину на базі препарату хідну кількість розчину Квіл-А пропускають в Амфіген виготовляють, як описано в Прикладі 3, і судину крізь лінію всмоктування. Після закінчення препарат виготовляють шляхом апаратного перепереміщення розчину Квіл-А пляшку забирають. мішування (bench blend), як описано в Прикладі 4, Таким же чином в судину для змішування перемівикористовують для порівнянні розміру краплинок щують необхідну кількість розчину холестерину в у вакцинних препаратах. Два мілілітри зразка кожетанолі (18мг/мл). Далі у судину для змішування ного препарату додавали у лазерний дифрактододають необхідну кількість препарату Амфіген, метр Malvern 2000 і визначали розподіл розміру 10% розчину тимеросалу і базове модифіковане краплинок. Як показано на Фігурі 3, результати середовище Ігла (БМІ), розчини наповнювача. демонструють, що мікрофлюїдизована вакцина на Після закінчення додавання перемішування базі препарату Амфіген має максимальний об'єм продовжують ще протягом 15хв. одержаний прерозподілу частинок близько 0,1мкм, тоді як не мікпарат розділяють на аліквоти (дози) по 2мл і він рофлюїдизована вакцина на базі препарату Амфіявляє собою не мікрофлюїдизовану БВД вакцину ген має максимальний об'єм розподілу частинок на базі препарату Амфіген. Кожна доза вакцини близько 1мкм. містить 500мкг Квіл-А, 500мкг холестерину, 2,5% Приклад 6 препарату Амфіген і 0,009% тимеросалу. КонцентЗменшення розділення фаз вакцини рацію антигену для двох різних штамів БВД визнаТри різних препарати вакцин: не мікрофлюїдичають в значеннях титру ELISA за gp53. зована вакцина на базі препарату Амфіген, вигоПриклад 3 товлена, як описано в Прикладі 2, мікрофлюїдизоВторинне змішування шляхом мікрофлюїдизавана вакцина на базі препарату Амфіген, ції виготовлена, як описано в Прикладі 3, і препарат Фігура 2 ілюструє процес, який використовувакцини, виготовлений шляхом апаратного переють для вторинного змішування шляхом мікрофмішування (bench blend), як описано в Прикладі 4, люїдизації. Мікрофлюїдизатор стерилізують папорівнювали бік-о-бік для визначення властивосром. Спершу у модулі встановлюють модуль тей розділу фаз при тривалому зберіганні. Всі вкакамери для допоміжної обробки та в друге полозані препарати зберігали при 4°С протягом прибження для камери встановлюють холосту камеру. лизно одного місяця і контролювали розділення Судину, яка містить БВД вакцину з повним склафаз за появою кремоподібного шару у верхній дом, готують, як описано в Прикладі 2, приєднують частині вакцинних препаратів. Як показано на Фідо мікрофлюїдизатора шляхом приєднання перегурі 4, в мікрофлюїдизованому препараті на базі хідної лінії від клапану дренажу постачальної супрепарату Амфіген не відбувалося розділення! дині до вхідного отвору мікрофлюїдизатора. Лінію фаз в порівнянні з двома іншими препаратами. подачі газоподібного азоту приєднують до фільтру Приклад 7 вхідного отвору для постачання судини повітря і Виготовлення мікрофлюїдизованої і не мікротиск в судині доводять до 20±5фунт/дюйм2. Дрефлюїдизованої вакцини для крупної рогатої худонажний клапан судини для збирання приєднують би проти бичачого вірусу вірусної діареї до перехідної лінії від вихідного отвору мікрофлюВірусний антиген бичачої вірусної діареї був їдизатора. Після здійснення всіх необхідних з'єдвнутрішньо інкорпорований в препарат Амфіген нань клапани відкривають і розпочинають мікрофшляхом мікрофлюїдизації. Термін "внутрішньо люїдизацію з робочим тиском інкорпорований" стосується процесу, коли антиген 2 10000±500фунт/дюйм . Повну кількість вакцини додають до препарату Амфіген перед мікрофлюї 25 89631 26 дизацією. Антиген обробляють, застосовуючи фічно. Ректальну температуру в день 0 вимірювали зичні сили процесу мікрофлюїдизації, разом з комдо введенням досліджуваного продукту. понентами ад'ювантного препарату. В контрольній Як показано на Фігурі 6, результати демонне мікрофлюїдизованій групи препарат антигену струють різке збільшення ректальної температури диспергували в препараті Амфіген шляхом змішупротягом приблизно 24год після вакцинації у твавання. рин, вакцинованих однією або двома дозами не Кінцевий склад контрольного і мікрофлюїдизомікрофлюїдизованого вакцинного препарату. Одваного препаратів був наступним: БВД типу І з нак, у тварин, вакцинованих мікрофлюїдизованими титром ELISA після інактивації 2535 відносних формами вакцини, збільшення ректальної темпеодиниць на дозу для gp53, БВД типу II з титром ратури після вакцинації було мінімальним і значно ELISA після інактивації 3290 відносних одиниць на меншим, ніж у тварин, вакцинованих не мікрофлюдозу для gp53, Квіл-А в концентрації 1,25мг/дозу, їдизованим препаратом (Фігурі 6). холестерин в концентрації 1,25мг/дозу, препарат Приклад 10 Амфіген в кінцевій концентрації 2,5% і тимеросап в Обсяг реакції в місці ін'єкції зменшувався швикінцевій концентрації 0,009%. Доза вакцини станодше при вакцинації мікрофлюїдизованими вакцинвила 5мл. ними препаратами Приклад 8 Мікрофлюїдизовані і не мікрофлюїдизовані ваСтабільність внутрішньо інкорпорованих кцинні препарати, виготовлені як описано в ПрикБВД;вірусних антигенів в мікрофлюїдизованому ладі 7, застосовували для вакцинації великої рогапрепараті вакцини на базі препарату Амфіген тої худоби в день 0. Тварини, включені в це Даний експеримент проводили з метою визнадослідження, були гібридними телятами м'ясної чення стабільності внутрішньо інкорпорованого худоби. В кожній з груп, що одержували плацебо антигену під час тривалого зберігання. Антиген (Т01 і Т02), було по три тварини. В кожній з груп вбитого вірусу БВД типу II був внутрішньо інкорповід Т03 до Т06 було по 6 тварин. Доза вакцини рований в препарат Амфіген під час процесу мікстановила 2мл і групи вакцинували однією або рофлюїдизації з одержанням мікрофлюїдизованодвома дозами вакцини в день 0. В день 0 досліго препарату вакцини (А907505). Три інших джуваний препарат вводили в праву частину шиї. вакцинних препарати, які містили однаковий антиТваринам, які одержували подвійну дозу (4мл) ген в не мікрофлюїдизованому препараті Амфіген досліджуваного препарату (Т02, Т04 і Т06), вводи(А904369, А904370 і А904371), служили контроли подвійну дозу у вигляді однієї ін'єкції в одне лем. В не мікрофлюїдизованих препаратах антимісце. Спостереження за місцями ін'єкції, в тому ген змішували з препаратом Амфіген і перемішучислі оцінку величини реакції в місці ін'єкції, здійсвали з використанням гомогенізатора Ross. Всі нювали на правому боці шиї в дні 0-4, включно, а чотири вакцинних препарати зберігали при 4°С також в дні 6, 9 і 14. В день 0 місця ін'єкцій оглядапротягом двох років. В різні моменти часу протяли перед введенням досліджуваного продукту. гом зберігання (0, 6, 12 або 24 місяці), всі чотири Тварини в групах, які вакцинували однією або препарати застосовували для вакцинації корів двома дозами плацебо, не демонстрували значновіком 3 місяці. го збільшення обсягу реакції в місці ін'єкції, тому В дні 0 і 21 здійснювали вакцинацію корів віком відповідні дані на Фігурі 7 не наведені. У випадку 3 місяців шляхом підшкірного введення 2мл вакне мікрофлюїдизованого вакцинного препарату цинного препарату. Сироватку вакцинованих тваспостерігалося пропорційне збільшення виражерин збирали на 35-й день і серологічну реакцію на ності реакції в місці ін'єкції для одно-дозової і двовакцину вимірювали з визначення титру антитіл за дозової вакцинації. З іншого боку, у випадку мікдопомогою BVDV-E2 ELISA. Як показано на Фігурі рофлюїдизованого вакцинного препарату, хоча 5, мікрофлюїдизований вакцинний препарат деперша доза спричиняла більш виражену реакцію в монстрував більш високий титр антитіл у всі досмісці ін'єкції, введення другої дози не спричиняло ліджені моменти часу (0, 6, 12 і 24 місяці), вказуюподальшого збільшення. Більше того, у випадку чи на те, що стабільність антигенного препарату ін'єкції тваринам мікрофлюїдизованого вакцинного не втрачається під час внутрішнього інкорпорупрепарату, обсяг реакції в місці ін'єкції зникав вання антигену під час процесу мікрофлюїдизації. швидше в порівнянні з тваринами, вакцинованими Більше того, також було несподівано виявлено, що не мікрофлюїдизованим вакцинним препаратом. мікрофлюїдизований вакцинний препарат виклиДані результати наведені на Фігурі 7. кає підсилену імунну реакцію у всі періоди часу. Приклад 11 Приклад 9 Виготовлення мікрофлюїдизованих вакцинних Зменшення спричиненого вакциною підвипрепаратів на базі препарату Амфіген з внутрішщення ректальної температури після мікрофлюїньо інкорпорованими антигенами вірусу БВД і дизації Leptospira та імуностимулювапьними молекулами, Мікрофлюїдизовані і не мікрофлюїдизовані ватакими як Квіл-А і ДДА кцинні препарати, виготовлені, як описані у ПрикІнактивований формаліном штам Leptospira ладі 7, застосовували для вакцинації великої рогаhardjo-bovis CSL вводять в придатний ад'ювант в 9 тої худоби в день 0 і контролювали ректальну прямих кількостях приблизно 1,4x10 мікроорганітемпературу протягом періоду від одного дня до змів на дозу 5мл. Інактивований формаліном штам вакцинації до 4 днів після вакцинації. Доза вакцини Leptospira pomona T262 вводять в кількості прибстановила 2мл. Групи вакцинували однією або лизно 2400 нефаломерних одиниць на дозу 5мл. двома дозами вакцини. Ректальну температуру Нефаломерні одиниці обчислювали на базі нефавимірювали і реєстрували щоденно в дні 1-4 вклюлометричного вимірювання попередньо обробле 27 89631 28 ної ферментаційної рідини. Вірус БВД типу І ввоВакцинний препарат, який використовували в дять з титром Е2 ELISA приблизно 3000 відносних даному експерименті, містив антигени вірусу БВД одиниць на дозу 5мл. Вірус БВД типу II вводять з типу І і типу II. Антиген BVD1-5960 використовуватитром Е2 ELISA приблизно 3500 відносних одили з титром ELISA після інактивації 2535 відносних ниць на дозу 5мл. Відносну одиницю обчислювали одиниць на дозу для gp53. Антиген BVD1-890 вина базі титру Е2 ELISA в нерозфасованій рідині користовували з титром ELISA після інактивації після активації перед збиранням вакцини. Квіл-А і 3290 відносних одиниць на дозу для gp53. Квіл-А і холестерин використовували в концентрації 0,5мг холестерин використовували з концентрацією на дозу. Тимеросал і препарат Амфіген викорис0,5мг/мл. Тимеросал і препарат Амфіген використовували в кінцевій концентрації 0,009% і 2,5%, товували в кінцевій концентрації 0,009% і 2,5%, відповідно. Алюмінію гідроксид (Rehydragel LV) відповідно. Якщо ДДА використовували як імунозастосовували у кінцевій концентрації 2,0%. Якщо модулятор, ДДА включали в препарат Амфіген. ДДА використовували як імуномодулятор, ДДА Запасний розчин Амфіген (40% розчин лецитину включали в препарат Амфіген. Препарат Амфіген Дракеол) містив різні кількості ДДА і при відповід(тобто, запасний 40% розчин лецитину Дракеол), ному розбавленні кінцева концентрація у вакцинмістить 1,6мг/мл ДДА і, при відповідному розбавному препараті становить 2,5% препарату Амфіген ленні, кінцевий препарат вакцини містить 2,5% і ДДА в концентрації від 0,5мг/дозу до 2,0мг/дозу. препарату Амфіген та 0,1мг/мл ДДА. Гель алюмінію (Rehydragel-LV) використовували в При виготовленні різних вакцинних препаратів фінальній концентрації 2%. GPI-2000 використовуфракції БВД, Leptos, Квіл-А, холестерин, тимеровали в інтервалі 2, 3 і 5 мг/дозу. сал, препарат Амфіген і сольовий розчин як напоВсі компоненти додавали в гомогенізатор внювач додавали у гомогенізатор Silverson і зміSilverson і змішували протягом 15хв при шували протягом 15хв при 10000±500об./хв. Далі 10500об./хв і далі здійснювали мікрофлюїдизацію здійснювали мікрофлюїдизацію компонентів крізь пропусканням крізь камеру 200 мікрон з тиском 2 2 сито 200 мікрон при 10000фунт/дюйм . 10000фунт/дюйм . Якщо вакцинний препарат місЯкщо вакцинний препарат містить алюмінію гітив алюмінію гідроксид, мікрофлюїдизацію здійсдроксид, мікрофлюїдизацію здійснюють без алюнювали без алюмінію гідроксиду. Після закінчення мінію гідроксиду. Після закінчення мікрофлюїдизамікрофлюїдизації додавали алюмінію гідроксид і ції додають алюмінію гідроксид і перемішують за змішували за допомогою мішалки протягом ночі допомогою мішалки протягом ночі при 4°С. при 4°С. Приклад 12 Приклад 13 Виготовлення вакцини вірусу БВД для досліЗахист від навантаження Leptospira після вакдження вірусного навантаження цинації мікрофлюїдизованим вакцинним препаратом Амфігену з антигенами Leptospira Таблиця 1 Групи лікування Група лікування Т01 Т02 T03 Т04 Т05 Склад ад'юванту Сольовий розчин Квіл-А, холестерин, препарат Амфіген (ПА) Квіл-А, холестерин, препарат Амфіген, AIOH ДДА, холестерин, препарат Амфіген ДДА, холестерин, препарат Амфіген та AIOH (ДДА-AIOH) В табл. 1 показано склад ад'ювантних препаратів у вакцинних препаратах, які вивчали в даному дослідженні. Вакцинні препарати готували, як описано в Прикладі 11. В кожній групі було 6 тварин. В даному дослідженні використовували гібридних телиць м'ясної худоби віком приблизно сім місяців. Вакцинацію здійснювали в день 0 і день 21 шляхом підшкірної ін'єкції об'єму вакцини 5мл. Навантаження здійснювали за допомогою штаму L hardjobovis 203 від NADC (National Agricultural Disease Center). Навантаження здійснювали протягом днів 57-59 інокуляцією 1мл. Навантаження водили кон'юнктивально в око та інтравагінально. Матеріал навантаження містив 5,0x106 лептоспір/мл. Зразки сечі збирали щотижня для культивування лептоспір, FA і ПЛР. Зразки нирок брали в дні 112 і 113. 29 89631 30 Таблиця 2 Результати дослідження навантаження Leptospira Відсоток телят, пози- Відсоток телят, пози- Відсоток телят, пози- Відсоток телят, позитивних на Leptospira в тивних на Leptospira в тивних на Leptospira в тивних на Leptospira в Лікування сечі і нирках за дани- сечі і нирках за дани- сечі і нирках за дани- сечі і нирках сумарно ми культури ми FA ми ПЛР за всіма пробами Сольовий розчин 100 83,3 83,3 100 ПА 0 0 0 0 ПА/АІОН 0 50,0 0 50,0 ДДА 0 0 0 0 ДДА/AIOH 0 33,3 16,7 50,0 В табл. 2 показані дані дослідження навантаження Leptospira. У визначенні відсотка інфекції Leptospira у тварини з навантаженням використовували наступні критерії. Якщо культура нирок була позитивною тільки для одного зразка, тварину вважали позитивною на Leptospira. Якщо тварина була позитивною тільки за одним зразком за (FA або ПЛР), тварину вважали негативною. Якщо результати були позитивним (FA і ПЛР) тільки для одного зразка, тварину вважали позитивною на Leptospira. Результати, наведені в табл. 2, показують значно меншу тривалість виділення патогенів з сечею у всіх групах вакцинації на базі всіх трьох аналізів. Як тільки розглядалося колонізація сечових шляхів і нирок, ефективність ПА- і ДДА-вмісних препаратів без АІОН була приблизно однаковою. АІОН не покращував і навіть зменшував ефективність ПА- і ДДА-вмісних вакцин в даному дослідженні навантаження. Таблиця 3 Інтервал титру мікроскопічної аглютинації в день пікового значення геометричного середнього титру перед навантаженням (день 35) Лікування Сольовий розчин ПА ПА/АІОН ДДА ДДА/АІОН L Hardjo