Рослина ячменю з повною втратою активності lox-1 ферменту

1. Рослина ячменю або її частина, яка має мутацію в LOX-1 гені, що викликає повну втрату функції, причому зазначена мутація приводить до одержання гена, який кодує поліпептидну форму LOX-1, що не має всіх або принаймні частини амінокислот від 520 до 862 з LOX-1 ячменю дикого типу (SEQ ID NO: 3 або 7). 2. Рослина ячменю або її частина за п. 1, у якій частина зазначеної рослини ячменю являє собою зерно (зерна). 3. Рослина ячменю або її частина за будь-яким з пп. 1 або 2, у якій ген, що кодує LOX-1 рослини, включає передчасний антисмисловий кодон. 4. Рослина ячменю або її частина за п. 3, у якій ген, який кодує LOX-1 рослини, включає антисмисловий кодон, який відповідає основам № 35723574 SEQ ID NO: 2. 5. Рослина ячменю або її частина за п. 3, вибрана з групи, яка складається з рослин, позначених D112, що мають інвентарний номер Американського зібрання типових культур (ATCC) PTA-5487, та потомства цих рослин. 6. Рослина ячменю або її частина за будь-яким з пп. 1 або 2, у якій ген, що кодує LOX-1 рослини, включає принаймні одну мутацію у межах місця сплайсингу. 7. Рослина ячменю або її частина за п. 6, у якій ген, який кодує LOX-1 рослини, включає мутацію у місці сплайсингу, що відповідає основі № 2311 SEQ ID NO: 6. 8. Рослина ячменю або її частина за п. 6, вибрана з групи, яка складається з рослин, позначених A618, що мають інвентарний номер ATCC PTA5584, та потомства цих рослин. 9. Рослина ячменю або її частина за будь-яким з пп. 1-8, що характеризується: (і) підвищеною стійкістю до хвороб; або (іі) зниженим потенціалом щодо вироблення мікотоксинів; або (ііі) тим, що має відновні клітини для застосування у тканинній культурі; або (іv) будь-якою комбінацією властивостей (i)-(iii). 10. Рослина ячменю або її частина за п. 9, у якій ген LOX-1 включає: (і) передчасний антисмисловий кодон; або (іі) мутацію у місці сплайсингу. UA (21) a200610769 (22) 09.03.2005 (24) 25.02.2010 (86) PCT/DK2005/000160, 09.03.2005 (31) 10/800,200 (32) 11.03.2004 (33) US (46) 25.02.2010, Бюл.№ 4, 2010 р. (72) БРЕДДАМ КЛАУС, DK/DK, ОЛЬСЕН ОЛЕ, DK/DK, СКАДХАУГЕ БІРГІТТ, DK/DK, ЛОК ФІНН, DK/DK, КНУДСЕН СЬОРЕН, DK/DK, БЕХ ЛЕНЕ МЬОЛСКОВ, DK/DK (73) КАРЛСБЕРГ А/С, DK (56) WO 2004085652 A, 07.10.2004 US 2003167544 A, 04.09.2003 WO 02053721 A, 11.07.2002 WO 02053720 A, 11.07.2002 KURODA H ET AL: "Characterization of factors that transform linoleic acid into diand trihydroxyoctadecenoic acids in mash" JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING, ELSEVIER, AMSTERDAM,, NL, vol. 93, no. 1, 2002, pages 7377, KOBAYASHI ET AL.: "Behavior of Mono-, Di-, and Trihydroxyoctadecenoic Acids during Mashing and Methods of Controlling Their Production" JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING, vol. 90, no. 1, 2000, pages 69-73, RUTGERSSON A ET AL: "OPTIMIZATION OF TEMPERATURE, TIME, AND LACTIC ACID CONCENTRATION TOINACTIVATE LIPOXYGENASE AND LIPASE AND PRESERVE PHYTASE ACTIVITY INBARLEY (CV. BLENHEIM) DURING SOAKING" CEREAL CHEMISTRY, AMERICAN ASSOCIATION OF CEREAL CHEMISTS. MINNEAPOLIS, US, vol. 74, no. 6, 1997, pages 727-732, DROST B W ET AL: "FLAVOR STABILITY" JOURNAL OF THE AMERICAN SOCIETY OF BREWING CHEMISTS, AMERICAN SOCIETY OF BREWING CHEMISTS, ST PAUL, MN, US, vol. 48, no. 4, 1990, pages 124-131, KURODA ET AL.: "Enzymes that Transofrm Linoleic Cid into Di- and Trihydroxyoctadecenoic Acids in Malt" MASTER BREWERS ASSOCIATION OF THE AMERICAS, vol. 40, no. 1, 2003, pages 11-16, 2 (19) 1 3 89632 4 11. Рослина ячменю за п. 10, у якій ген LOX-1 включає: (і) антисмисловий кодон, який відповідає основам № 3572-3574 SEQ ID NO: 2; або (іі) мутацію у місці сплайсингу, яка відповідає основі № 2311 SEQ ID NO: 6. 12. Рослинний продукт, одержаний з рослини ячменю або її частини за будь-яким з пп. 1-11. 13. Рослинний продукт за п. 12, у якому рослинний продукт являє собою композицію, що містить рослину ячменю або її частину за будь-яким з пп. 111. 14. Рослинний продукт за п. 12, у якому рослинний продукт являє собою композицію солоду, яка включає оброблену рослину ячменю або її частину, де рослиною ячменю є рослина ячменю за будь-яким з пп. 1-11. 15. Рослинний продукт за п. 14, у якому частина зазначеної рослини ячменю являє собою зерно (зерна). 16. Рослинний продукт за п. 12, у якому рослинний продукт являє собою композицію сусла, одержану із застосуванням рослини ячменю або її частини за будь-яким з пп. 1-11 або із застосуванням композиції солоду, одержаної з рослини ячменю або її частини, або їх сумішей. 17. Рослинний продукт за п. 16, у якому частина зазначеної рослини являє собою зерно (зерна). 18. Рослинний продукт за п. 16, у якому композиція солоду є композицією солоду за будь-яким з пп. 14 та 15. 19. Рослинний продукт за будь-яким з пп. 16-18, у якому композицію одержують, застосовуючи композицію ферменту або композицію суміші ферментів. 20. Рослинний продукт за п. 12, у якому рослинний продукт являє собою композицію, одержану з суміші (i) композиції, яка включає рослину ячменю або її частину за будь-яким з пп. з 1 по 11 та (ii) композиції солоду за будь-яким з пп. 14 та 15. 21. Рослинний продукт за п. 12, у якому рослинний продукт являє собою композицію сусла або напою, одержаного з композиції за п. 20. 22. Рослинний продукт за п. 12, у якому рослинний продукт являє собою напій, який має стійкі органолептичні якості, причому напій одержаний шляхом переробки рослини ячменю або її частини за будьякимз пп. 1-11. 23. Рослинний продукт за п. 22, у якому напій являє собою пиво. 24. Рослинний продукт за п. 22, у якому напій одержаний із застосуванням солоду, одержаного із зерен рослини ячменю. 25. Рослинний продукт за будь-яким з пп. 22-24, у якому напій виготовлений із композиції сусла, оде ржаної з рослини ячменю або її частини або з композиції солоду, одержаної з рослини ячменю або її частини. 26. Рослинний продукт за п. 22, у якому напій виготовлений із неосолодженої рослини ячменю або її частини. 27. Рослинний продукт за будь-яким з пп. 22 та 2426, у якому напій є незбродженим напоєм. 28. Рослинний продукт за будь-яким з пп. 22-27, у якому рослина ячменю або її частина включають LOX-1 ген, причому ген включає: (і) антисмисловий кодон; або (іі) мутацію у місці сплайсингу. 29. Рослинний продукт за п. 28, у якому ген, який кодує LOX-1, включає: (і) антисмисловий кодон, який відповідає основам № 3572-3574 SEQ ID NO: 2; або (іі) мутацію у місці сплайсингу, яка відповідає основі № 2311 SEQ ID NO: 6. 30. Рослинний продукт за п. 12, у якому рослинний продукт являє собою харчову композицію, кормову композицію або композицію, яка є ароматичною сировиною, що включає рослину ячменю або її частину за будь-яким з пп. 1-11. 31. Спосіб одержання: (і) харчової композиції; або (іі) кормової композиції; або (ііі) композиції, яка є ароматичною сировиною; або (іv) будь-якої комбінації за пп. (i)-(iii); із застосуванням рослини ячменю або її частини за будь-яким з пп. 1-11. 32. Спосіб одержання напою, який має стійкі органолептичні якості, у якому: (і) одержують композицію, що включає рослину ячменю або її частини за п. 1; (іі) переробляють композицію (i) у напій; з одержанням напою зі стійкими органолептичними якостями. 33. Спосіб за п. 32, у якому в (i) одержують композицію солоду з зерен рослини ячменю або її частини. 34. Спосіб за будь-яким з пп. 32 та 33, у якому додатково виконують інкубацію з інгібітором LOX. 35. Спосіб за п. 32, у якому переробка композиції у напої включає етап затирання. 36. Спосіб за п. 32, у якому інгібітор LOX додають під час етапу затирання. 37. Спосіб одержання композиції солоду з відсутністю активності LOX-1, у якому: (і) забезпечують зерна за п. 2; (іі) вимочують зерна; (ііі) пророщують вимочені зерна у заданих умовах; (іv) виконують теплову обробку пророщених зерен; з одержанням композиції солоду, яка не має активності LOX-1. Даний винахід стосується рослинної біотехнології, яка розкриває застосування ячменю та солоду, який не синтезує ферменту ліпоксигенази (LOX) LOX-1, таким чином, забезпечуючи нову сировину для промислового застосування. Напри клад, вищезгадана сировина може застосовуватися для виробництва нового й оригінального пива зі стійким смаком, яке не містить або майже не містить сполуки, яка надає стороннього присмаку, транс-2-нонеяалу (T2N). Вищезгаданий T2N утво 5 рюється через послідовну дію ферментів шляху LOX, де LOX-1 представляє первинну активність, яка забезпечує діоксигенування лінолевої кислоти для одержання 9-гіперпероксіоктадекадієнової кислоти (9-HPODE). Ячмінь та рослинні продукти згідно з винаходом не містять або містять лише незначну кількість 9-HPODE. Крім того, винахід стосується напоїв, виготовлених із застосуванням вищезгаданого ячменю та/або солоду. Одна з цілей досліджень, які стосуються сучасного виробництва пива, полягає у визначенні молекулярних факторів для якості та стійкості пива. Велика частка пива виробляється на основі ячменю (Hordeum vulgare, L.). Він являє собою однодольну харчову рослину, яку вирощують у багатьох частинах світу не лише через економічне значення як джерела промислових продуктів, таких як пиво, але й як кормову культуру для тварин. Сполучені Штати Америки нині одним з провідних виробників солодового ячменю, вирощуючи близько 13% світового врожаю; Канада, Австралія та Європа разом вирощують близько 70% врожаю (Bios Intern., 2001). Зусилля селекціонерів ячменю незмінно спрямовані на виведення стійких, високоврожайних культур, якісних з агрономічної точки зору. Заходи, які вживають для досягнення цієї мети, включають випадковий мутагенез шляхом хімічної обробки або опромінення для зміни відповідних властивостей, наприклад, для зміни експресії конкретних генів, які можуть мати негативний вплив на ріст рослин та врожайність взагалі, а також на характеристики, які забезпечують додаткову якість продукту, виробленого з культури. Загальновідомо, що азид натрію, NaN3, є хімічною сполукою, яку застосовують для мутагенізації ячменю. Зокрема, викликаний NaN3 мутагенез застосовують для викликання генетичних змін у ячмені для створення мутантів з блокованим синтезом антоціанінів та проантоціанідинів (von Wettstein et al., 1977; von Wettstein et al., 1985; Jende-Strid, 1991; Jende-Strid, 1993; Olsen et al., 1993). Другий приклад стосується зерен ячменю, мутагенізованих із застосуванням NaN3 для відбору на високий рівень вільного фосфату з метою розпізнання низькофталатних мутантів (Rasmussen and Hatzak, 1998); загалом було розпізнано 10 мутантів з 2000 перевірених зерен. Хоча головним недоліком у генетиці ячменю є неможливість точного дослідження функції гена шляхом зворотної генетики, прямий генетичний відсів - наприклад, після викликаного NaN3 мутагенезу - продовжують застосовувати у пошуках поліпшень, які стосуються поживних та якісних параметрів ячменю та солоду. За винятком великомасштабних і загальних прогнозів, селекціонер не може передбачити результат виведення нових рослинних ліній у традиційному процесі селекції рослин. Ця непередбачуваність викликається, головним чином, відсутністю контролю на клітинному рівні, тобто на рівні ядерної ДНК, що є надзвичайно складним процесом. На результат процесу селекції рослин впливають багато чинників, наприклад, клімат та якість ґрунтів на географічній території поширення рослини. В результаті різні селекціонери ячменю, які засто 89632 6 совують традиційні способи, не спроможні вивести рослини з ідентичними характеристиками. У традиційному процесі селекції найважчим завданням є виявлення рослин, які мають генетичні переваги не лише з огляду на потрібні властивості, але й з врахуванням фізіологічних чинників росту рослин. Процес відбору є особливо важким, коли сторонні властивості маскують потрібну властивість. Коли у сучасних процедурах селекції рослин застосовують визначення послідовності ДНК мутованого гена, його здійснюють на останньому етапі програми селекції - тобто після характеризації мутанта, наприклад, як було описано нещодавно для відбору викликаних хімічним шляхом мутацій в Arabidopsis та інших рослинах (Colbert et al., 2001). На даний час існують повідомлення про створення генно-індексованих мутацій з втратою функції у масштабі повного геному у дріжджах Saccharomyces cerevisiae (Giaever et al., 2002). Для рослини Arabidopsis 21 700 з приблизно 29 454 прогнозованих генів було інактивовано шляхом вставлення послідовностей Т-ДНК Agrobacterium (Alonso et al., 2003). До нинішнього часу цілком звичною є ситуація, коли традиційний процес селекції від першого мутагенезу або схрещування з існуючими на ринку рослинами або насінням займає >10 років. Дуже бажано було б забезпечити для селекціонерів рослин способи виявлення мутацій у гені, пов'язаному з потрібною властивістю. Такі поліпшення підвищили б рівень прогнозованості у програмах селекції, зокрема, у випадках, коли відбір мутантів є спрямованим на такі, що мають антисмислові мутації в кодуючій білок частині потрібного гена. В інших випадках перевагу віддають ранньому виявленню мутацій ДНК, наприклад, для виключення подальшого схрещування з лініями, які характеризуються мутаціями промотора у відповідному гені, або коли інші мутації ДНК впливають на експресію - лише через те, що екологічні або фізіологічні чинники можуть викликати реверсію властивості, викликаної мутагеном. Відповідно, існує потреба в альтернативних способах виявлення потрібних мутацій на ранніх стадіях програми селекції. Це прискорює весь процес селекції і робить його економічнішим, таким чином, забезпечуючи максимальну кількість зерна, вирощеного на землі. Основну частину вирощуваного ячменю становлять осолоджувані сорти, зерна яких перетворюються на солод через контрольовані процеси вимочування, пророщування та висушування ячменю. Меншу частину солоду застосовують як інгредієнти у харчовій промисловості, а більшість солоду згодом застосовують як головний інгредієнт у виробництві одержуваних із солоду напоїв, включаючи, крім інших, пиво та віскі. На пивоварному заводі перемелений солод піддають процесові затирання, який включає ступеневе підвищення температури суспензії солоду у воді, яке забезпечує часткове ферментне розщеплення та екстрагування, наприклад, крохмалю полімерів зерен та β-глюкану. Після фільтрації водну пульпу варять з хмелем для одержання сусла. Вищезгадане сусло після цього ферментують з дріжджами, одержуючи пивний продукт, який після дозрівання 7 розливають у пляшки. Сусло також застосовують для виробництва неферментованих солодових напоїв. Апетитність та смакова стійкість напою є важливим чинником, який стосується композиції ячменю та солоду. Причиною цього є те, що природні смакові молекули, які походять із вищезгаданих ячменю та солоду - або утворені під дією ферментів, видобутих із вищезгаданих ячменю та солоду можуть надавати готовому продуктові небажаних смакових характеристик (Drost et al., 1990). У цьому відношенні утворення леткої сполуки, яка надає "картонного" присмаку, являє особливий інтерес як з біохімічної, так і з економічної точки зору. У 1970 році молекулу, яка зумовлює "картонний" присмак, було виділено й розпізнано як T2N, дев'ятьвуглець (С9) алкенал (Jamieson and Gheluwe, 1970). Оскільки рівень порогу смакової чутливості для T2N у людей є надзвичайно низьким, за попередніми визначеннями - приблизно 0,7нМ або 0,1ppb (Meilgaard, 1975), продути навіть з незначним рівнем альдегіду сприймаються як прострочені через сторонній присмак продукту. Крім того, вивільнення T2N з розщеплюваних адуктів T2N під час зберігання пива може спричинити псування продукту (Nyborg et al., 1999). Дослідження з радіоактивним міченням рослинної тканини показали, що ноненали походять від С18 жирної кислоти лінолевої кислоти, тоді як гексанали та нонадієнали утворюються з С18 жирної кислоти ліноленової кислоти (Grosch and Schwartz, 1971; Phillips and Galliard, 1978). Ці та численні наступні спостереження - наприклад, згадані у публікаціях Tijet et al. (2001), Noordermeer et al. (2001) та Matsui et al. (2003) - розглядались як свідчення того, що T2N утворюється через послідовну дію специфічних до шляху LOX ферментів, коли дія LOX представляє ранній ферментний етап. Дотримуючись цієї ідеї, Kurodo et al. (2003) виявили, що солод містить стійкий до нагрівання ферментний фактор, який є необхідним для трансформації продуктів, утворених LOX, на T2N. Ячмінне зерно містить три ферменти LOX, відомі як LOX-1, LOX-2 та LOX-3 (van Mechelen et al., 1999). Якщо LOX-1 каталізує утворення 9HPODE - прекурсора T2N, а також тригідроксіоктадеценових кислот (скорочено "ТНОЕ" або просто "ТНА") - з лінолевої кислоти, LOX-2 каталізує перетворення лінолевої кислоти на 13-HPODE, яка далі метаболізується до гексаналу (Фіг.1В), Сб альдегіду з рівнем смакового порогу приблизно 0,4ppm (Meilgaard, supra). Хоча специфічність LOX-3 до продукту залишається слабкою, дуже низький рівень експресії відповідного гена, як було показано у публікації Mechelen et al. (supra), вказує на те, що його внесок в утворення T2N є незначним. Тримають дослідження, які мають на меті визначення, чи є активність LOX єдиним ферментним джерелом для утворення гідропероксидних прекурсорів лінолевої кислоти, пов'язаних з утворенням Т2Н-специфічних сторонніх присмаків, чи процес самоокиснення жирної кислоти також має свій вплив. Показовим є те, що С18 гідропероксиди також можуть перетворюватися більш, ніж сімома різними родинами рослинних та тваринних фер 89632 8 ментів, і всі реакції мають спільну назву шлях LOX (Feussner and Wastemack, 2002); цей шлях також називають шлях оксиліпіну. Оксиліпіни, про що свідчить їхня назва, є окисненими похідними від ліпідів молекулами, які утворюються в результаті окиснення ненасичених жирних кислот через реакцію LOX, і до них також належать будь-які молекули, які походять від таких окиснених молекул. Ячмінні зерна та рослини ячменю, які мають білок LOX-1, який характеризується зниженою активністю, було описано у заявці РСТ/ІВО1/00207, опублікованій як WO 02/053721А1 від імені Douma et al. Однак вищезгадана заявка не розповідає про одержання та аналіз ячмінних зерен з неактивним ферментом LOX-1. Відомо кілька прикладів мутованих рослин, які синтезують LOX на низькому рівні. Наприклад, на початку 1980-х років було розпізнано три лінії сої, кожна з браком одного з трьох ферментів LOX у зрілому соєвому насінні: (і) LOX-1. Хоча молекулярна основа нульової мутації LOX-1 залишається невизначеною, вона корелюється з відсутністю відповідної зрілої мРНК (Hildebrandt and Hymowitz, 1982; Start et al., 1986); (ii) LOX-2. Було виявлено транскрипти для мутованого гена, і спостерігалася зміна однієї основи, яка замінює ліганд гістидину на атом заліза активного сайту, що веде до нестійкості ферменту (Davies and Nielsen, 1986; Wang et al., 1994); (ііi) LOX-3. Нульові мутанти LOX-3 не виявили помітного рівня відповідного транскрипту, можливо, через цис-діючі елементи у промоторі гена (Kitamura et al., 1983; Wang et al., 1995). У насінні гороху було виявлено, що нульова лінія LOX-2 має дефект, який призводить до відсутності більшості білка LOX-2 (Forster et al., 1999). Оскільки ця лінія виявила велике зниження кількості мРНК для LOX-2, було висловлено думку, що мутація викликала різке зниження стійкості мРНК. У рисі імуноблотинг екстрактів виявив присутність двох природних культур, Daw Dam та СІ-115, у кожній з яких бракувало одного з трьох ферментів LOX (Ramezanzadeh et al., 1999). Було визначено, що кількість гексаналу, пентанал та пентанолу у нормальному рисі з усіма трьома LOX помітно збільшувалася під час зберігання, тоді як у Daw Dam та СІ-115 вона знижувалася у межах від 66% до 80%. Незважаючи на те, що результати вказують, що відсутність ферментів LOX у рисовому зерні зменшує псування через окиснення, молекулярні чинники, які забезпечують характеристики Daw Dam та СІ-115, які вказують на відсутність, залишилися нез'ясованими. Опосередковане антисмисловою послідовністю та косупресією трансгенне виснаження генів, які кодують LOX, виявилося корисним для пояснення функції конкретних ферментів LOX та їхніх відповідних продуктів у захисному сигналі у рослинах. В Arabidopsis, наприклад, виснаження ферменту LOX призводило до зниження викликаного скарифікацією накопичення ясмонової кислоти (Bell et al., 1995). І результати опосередкованого антисмисловою послідовністю виснаження гена, який кодує LOX, дозволяють твердити про зв'язок відповідного ферменту з властивістю несумісності 9 рослини тютюну, резистентної до грибкового патогену (Ranсe et al., 1998). Третій приклад застосування трансгенного підходу для пояснення функцій LOX стосується ролі LOX картоплі під назвою LOX-H1 у рості та розвитку рослин картоплі (Leon et al., 2002). Було продемонстровано, що виснаження LOX-H1 в результаті веде до помітного зниження летких аліфатичних С6 альдегідів, сполук, які беруть участь у захисних реакціях рослин і діючих або як сигнальні молекули для викликаної скарифікацією експресії гена, або як протимікробні речовини. Подальше дослідження показано, що трансгенні рослини картоплі з виснаженням експресії гена для ферменту LOX демонстрували відхилення у розвитку бульб (Kolomiets et al., 2001). Однак конкретні оксиліпіни, які відповідають за фенотип бульб, не були розпізнані. В іншому дослідженні опосередковане антисмисловою послідовністю виснаження LOX-H3 картоплі пригнічувало індуцибельну захисну реакцію рослини, яка супроводжується підвищенням урожаю бульб (Royo et al., 1999). Разом ці дані свідчать, що експресія генів, які кодують ферменти LOX, є важливою для розвитку рослин, причому деякі ферменти LOX відіграють захисну роль проти патогенів, тоді як інші ферменти LOX створюють продукти, які можуть діяти для регулювання розвитку клітин. Важливо також зазначити, що плоди томатів зі зниженим на 2-20% рівнем двох ферментів LOX не виявили значних змін у летких ароматичних речовинах порівняно з плодами дикого типу (Griffiths et al., 1999). Цей факт вказує або на те, що дуже низький рівень LOX є достатнім для утворення альдегідів та спиртів, або на те, що в утворенні цих сполук є активними інші ферменти LOX. Окиснювальним ферментам приділяється дедалі більша увага у харчовій промисловості та виробництві напоїв через їхній вплив на важливі аспекти, пов'язані зі смаком та кольором продуктів рослинного походження. У цьому відношенні LOX привертають увагу через їхню здатність викликати утворення вільних радикалів, які можуть руйнувати інші складові, такі як вітаміни, колір, феноли, білки і т.ін. Слід зазначити, що деякі вільні радикали вважаються такими, що відіграють роль у самоокисненні вільних жирних кислот. Деякі речовини, які виробляють вільні радикали, можуть витримувати термічну обробку, а отже, зберігати достатню активність в оброблених продуктах харчування для того, щоб викликати зміни якості під час зберігання продукту. Антиоксиданти широко застосовуються як інгібітори LOX, деякі з яких також інгібують самоокиснення субстратів LOX. Однак не було розпізнано жодного з інгібіторів LOX, які можуть застосовуватись як домішки для напоїв, що поліпшують смак. Роль ферментів LOX також є пов'язаною з проблемами, які не належать до галузі виробництва пива, наприклад, з каталізованим LOX утворенням гіперперокси-жирних кислот, які інгібують утворення мікотоксину в рослинах, сприйнятливих до грибкових інфекцій, наприклад, описаних у Патенті США №5,942,661, виданому Keller. Хоча роль ферментів LOX у захисті рослин та реакції на скарифікацію залишається недостатньо з'ясованою, 89632 10 ферменти утворюються після скарифікації та імунізації патогенами (Bell and Mullet, 1991; Bell and Mullet, 1993; Melan et al., 1993; Sarvitz and Siedow, 1996). Роль ферментів LOX у скарифікації та захисті рослин може полягати у виробленні реакційноздатних гідропероксидів жирних кислот проти патогенів (Rogers et al., 1988). В альтернативному варіанті утворення LOX може бути викликане стресами для утворення сигнальних молекул, таких як метилясмонат (Bell et al., supra). Було також описано способи, у яких 13HPODE, вироблений під дією ферменту LOX, діє як субстрат для перетворюючих гідропероксид ферментів для вироблення альдегідів, які активізують смак (Noordermeer et al., 2002; Husson and Belin, 2002). Подібні процеси описано у численних патентах, наприклад, Патенті США №6,150,145, виданому Hausler et al., та Патенті США №6,274,358, виданому Holtz et al. Крім того, було виявлено, що ферменти LOX є корисними у хлібопекарській промисловості (Casey, 1997). Крім того, у Патенті США №6,355,862 В1, виданому Handa and Kausch, описано, що якість плодів може бути підвищена через інгібування вироблення LOX, наприклад, для подовження терміну зберігання продукту. Існує незадоволена потреба у рослинах ячменю, які практично не мають активності LOX-1, оскільки напої, вироблені з таких рослин, мають дуже низький рівень T2N. Крім того, даний винахід розкриває, що напої, вироблені з таких рослин, мають дуже низький рівень 9,12,13-ТНОЕ. Крім того, такі рослини можуть застосовуватися з іншими цілями. Несподівано даний винахід розкриває способи одержання рослин ячменю, які не мають або мають дуже низьку активність LOX-1. Зокрема, винахід розкриває нульові мутації у гені, який кодує LOX-1. До перспективних переваг винаходу належать повне усунення T2N з відповідної гілки шляху LOX, і винахід, таким чином, забезпечує чудовий спосіб контролю над рівнем T2N у ячмінних зернах; і пиво, вироблене з цих зерен, демонструє виключну стійкість смаку після тривалого зберігання, навіть при підвищених температурах. Цікавим є те, що даний винахід також забезпечує способи раннього виявлення мутацій, а отже, даний винахід усуває недоліки пізньої характеризації мутанта. У ньому застосовується нова приваблива процедура одержання культури ячменю з поліпшеним осолоджуванням, яка включає послідовне застосування характеризації фенотипу та визначення послідовності ДНК заданих генів у мутантній популяції у ранній момент часу у процесі селекції. Окремі рослини можуть бути піддані подальшому вдосконаленню з застосуванням різних способів селекції рослин. Даний винахід дозволяє позбутися поточних проблем, обмежень та недоліків, пов'язаних з присутністю активного ферменту LOX-1 у ячмені. Поперше, цей винахід забезпечує новий ефективний спосіб відбору, який значною мірою скорочує час та витрату праці на відбір хімічно мутагенізованого ячменю. По-друге, даний винахід стосується сортів ячменю з нульовим LOX-1, які є корисними, наприклад, у виробництві пива зі стійким смаком. 11 Теоретичний рівень техніки для рослинних LOX-мутантів, як описано вище, стосується рослин, які мають знижений рівень активності LOX. Натомість даний винахід дозволяє подолати обмеження та недоліки, пов'язані з низькою або залишковою активністю LOX для забезпечення способів ефективного одержання рослин ячменю з нульовим LOX-1. Розбіжності є такими: (і) На відміну від рослин ячменю, описаних у заявці РСТ/ІВ01/002О7, опублікованій як WO 02/053721А1 від імені Douma et al., рослини згідно з даним винаходом практично не мають активності LOX-1, в оптимальному варіанті ці рослини дійсно є рослинами з нульовим LOX-1 - тобто ці рослини є повністю позбавленими функції білка LOX-1; (іі) Дійсна властивість нульового LOX-1, як описано авторами, може бути розпізнана шляхом відбору на присутність нонсенс-мутації у відповідному гені. Відповідно, рослини ячменю, гомозиготні щодо цієї властивості, мають бути повністю блоковані у синтезі активного ферменту - незалежно від умов росту або впливу середовища. Ця властивість є ідеальною для галузі селекції рослин і контрастує з результатом можливого молекулярного сценарію у LOX-мутантах сої існуючого рівня техніки, коли біотичні та абіотичні умови можуть впливати на зміни у фізіологічному стані клітин для забезпечення стабілізації мРНК з наступною трансляцією LOX; (ііі) Якщо відповідна властивість у LOXмутантах сої та рису включає знижений рівень сполуки з інтенсивним запахом гексаналу у масових продуктах харчування, даний винахід стосується зниженого рівня сполуки T2N, яка відповідає за смак, у напої, а також зниженого рівня 9,12,13ТНОЕ у напої; (iv) LOX-мутанти сої та рису зазнають впливу у молекулах шляху LOX, розташованих за 13HPODE, тоді як властивість нульового LOX-1 стосується гілки шляху LOX, яка включає молекули, розташовані за 9-HPODE; (ν) Хоча мутанти сої включають викликані опроміненням мутації у генах, які кодують LOX, і Daw Dam та СІ-115 представляють вибрані природні культури селекційних ліній рису, мутації у рослинах ячменю, які мають властивість нульового LOX-1, було викликано хімічним NaN3. Отже, мета даного винаходу полягає у забезпеченні рослин ячменю, їх частин або фрагментів, які включають менше, ніж 5%, в оптимальному варіанті - менше, ніж 1% активності LOX-1 рослини ячменю дикого типу. Друга мета винаходу полягає у забезпеченні зерен рослини ячменю, які включають менше, ніж 5%, в оптимальному варіанті - менше, ніж 1% активності LOX-1 рослини дикого типу. Третя мета даного винаходу полягає узабезпеченні композицій, які включають рослину ячменю або її частини або фрагменти, які включають менше, ніж 5%, в оптимальному варіанті - менше, ніж 1% активності LOX-1 рослини ячменю дикого типу. Ще одна мета даного винаходу полягає у забезпеченні композицій солоду, які включають об 89632 12 роблену рослину ячменю, яка включає менше, ніж 5%, в оптимальному варіанті - менше, ніж 1% активності LOX-1 рослини ячменю дикого типу. Композиції солоду в оптимальному варіанті можуть бути чистими композиціями солоду. Однак композиції солоду також можуть бути, наприклад, сумішами ячменю та солоду. Ще одна мета даного винаходу полягає у забезпеченні напоїв, які мають стійкі органолептичні якості, причому вищезгадані напої виробляють із застосуванням рослин ячменю згідно з винаходом або їх частин. Зокрема, в оптимальному варіанті вищезгадані напої виробляють із застосуванням композиції солоду, такої як чиста композиція солоду або суміш ячменю та солоду, як було описано авторами вище. В оптимальному варіанті втілення винаходу вищезгадані напої складаються з пива. Додаткова мета винаходу полягає у забезпеченні напою, який має стійкі органолептичні якості, причому вищезгаданий напій виробляють із застосуванням рослини ячменю, і співвідношення 9,12,13-тригідроксіоктадеценової кислоти (у тексті під скороченою назвою 9,12,13-ТНОЕ або просто 9,12,13-ТНА) та 9,10,13-тригідроксіоктадеценової кислоти (у тексті під скороченою назвою 9,10,13ТНОЕ або просто 9,10,13-ТНА) у вищезгаданому напої становить не більше 1,8. В оптимальному варіанті вищезгаданим напоєм є пиво. Крім того, мета винаходу полягає у забезпеченні композицій, таких як харчові композиції, кормові композиції або композиції, які є ароматичною сировиною, які включають рослину ячменю згідно з винаходом або її частини. Крім того, мета даного винаходу полягає у забезпеченні способів експресії рекомбінантного білка у рослині ячменю згідно з винаходом, причому вищезгаданий спосіб включає перетворення вищезгаданої рослини нуклеїновокислотною послідовністю, яка включає, як функціонально зв'язані компоненти, промотор, який експресується в рослинах ячменю або їх частинах, послідовність ДНК, яка кодує вищезгаданий рекомбінантний білок, та транскрипційну кінцеву ділянку, таким чином, експресуючи вищезгаданий рекомбінантний білок у вищезгаданій рослині ячменю. Крім того, мета даного винаходу полягає у забезпеченні способів зниження рівня білка у рослині ячменю згідно з винаходом, причому вищезгаданий спосіб включає перетворення вищезгаданої рослини нуклеїновокислотною послідовністю, яка включає, як функціонально з'єднані компоненти, промотор, який експресується в рослинах ячменю або їх частинах, послідовність ДНК та транскрипційну кінцеву ділянку, причому експресія вищезгаданої послідовності ДНК знижує експресію гена, який кодує вищезгаданий білок за допомогою антисмислової послідовності або косупресії або РНКінтерференції. Додаткова мета даного винаходу полягає у забезпеченні способів одержання рослини ячменю, яка включає менше, ніж 5%, в оптимальному варіанті - менше, ніж 1 % активності LOX-1 рослини ячменю дикого типу, включаючи етапи: (і) визначення активності LOX-1 у ячмінних зернах дикого типу або її частинах; і 13 (іі) мутагенізації рослин ячменю та/або ячмінних зерен та/або зародків ячменю, з отриманням, таким чином, МО-ячменю; і (ііі) селекції вищезгаданих мутагенізованих рослин, зерен та/або зародків ячменю протягом принаймні 2 поколінь, з отриманням, таким чином, Мх рослин ячменю, де х є цілим числом 2; і (iv) одержання зерен або їх частин з вищезгаданих Мх рослин ячменю; і (ν) визначення активності LOX-1 у вищезгаданих зернах або їх частинах; і (vi) відбору рослин, у яких активність LOX-1 мутагенізованих зерен або їх частин є меншою, ніж 5% активності LOX-1 зерен дикого типу або їх частин; для одержання, таким чином, рослини ячменю, яка включає менше, ніж 5% активності LOX-1 рослини ячменю дикого типу. Ще одна мета даного винаходу полягає у забезпеченні способів виробництва напою, який має стійкі органолептичні якості, включаючи етапи: (і) забезпечення композиції солоду згідно з винаходом; (іі) переробки вищезгаданої композиції солоду у напій; для одержання, таким чином, напою зі стійкими органолептичними якостями. Додаткова мета даного винаходу полягає у забезпеченні способів одержання композиції солоду з низькою активністю LOX-1, включаючи етапи: (і) забезпечення зерен згідно з винаходом; (іі) вимочування вищезгаданих зерен; (Пі) пророщування вимочених зерен у заданих умовах; (iv) теплової обробки пророщених зерен; для одержання, таким чином, композиції солоду з низькою активністю або відсутністю активності LOX-1. В одному з оптимальних варіантів втілення даний винахід ґрунтується на несподіваному результаті функціональних досліджень мутанта ячменю D112 (який також називається авторами "мутант D112" або "ячмінь D112"), який виявив повну втрату функції щодо головного утворюючого 9HPODE ферменту LOX-1. Несподіваним відкриттям було виявлення розподілу 10%:90% 9HPODE:13-HPODE у біохімічних аналізах, передбачених для визначення профілю продукту після каталізованого LOX перетворення лінолевої кислоти. За надзвичайно низького смакового порогу T2N ще більш несподіваним було те, що розпад залишкового 9-HPODE і т.ін. у зернах мутанта D112 викликав лише дуже низьке вивільнення T2N - значно нижче рівня смакового порогу - під час витримування пивних продуктів, вироблених із солоду вищезгаданих зерен. Перевірка результатів аналізів із застосуванням зерен дикого типу та з нульовим LOX-1 чітко засвідчила, що висока активність LOX-1 надає інтенсивності несвіжому "картонному" присмакові T2N, таким чином, підтверджуючи важливу роль шляху LOX у контролі над утворенням алкеналу. Цей висновок контрастує з думкою Liegeois et al. (supra), згідно з якою активність LOX бере участь 89632 14 лише у невеликій частині молекул-прекурсорів T2N. Властивість нульового LOX-1 може бути включена у будь-яку іншу рослину ячменю, наприклад, традиційні сорти ячменю, наприклад, традиційні сорти осолоджуваного ячменю, що дозволяє, таким чином, виробляти напої зі стійким смаком і з подовженим терміном зберігання. Цього можна досягти, наприклад, традиційними способами селекції, загальновідомими серед спеціалістів у даній галузі. Цей підхід не залежить не тільки від географічного регіону, в якому вирощують похідний від мутанта D112 ячмінь, але й від місця, в якому виробляється й продається покупцям одержане з мутанта D112 пиво. Рослини ячменю, які є мутантом D112, або рослини, які від нього походять, потенційно є важливим економічним чинником для фермерів, які вирощують культуру, та для пивоварень, які використовують її як сировину для виробництва пива або виробництва інших напоїв на основі ячменю. В інших галузях застосування, які залежать від сировини без утворюючої 9HPODE/9-HPOTE активності також очікується позитивний вплив переваг властивостей мутанта ячменю D112. Згідно з одним варіантом втілення винаходу, забезпечується кілька нових мутантів осолоджуваного ячменю, наприклад, мутанта ячменю D112 або мутанта ячменю А618 (який також називається авторами "мутант А618" або "ячмінь А618"). Таким чином, даний винахід стосується зерен мутантів ячменю D112 або А618, рослин ячменю D112 або А618 та способів одержання рослини ячменю, яка походить від схрещування мутантів ячменю D112 або А618 між собою або з іншою лінією ячменю. Крім того, даний винахід включає варіанти з нульовим LOX-1, одержані шляхом мутагенезу або перетворення мутанта ячменю D112 або А618. Таким чином, усі рослини, одержані з застосуванням мутантів ячменю D112 або А618, або їх похідної як батьківські рослини охоплюються обсягом цього винаходу. В іншому аспекті винахід забезпечує відновлювані клітини для застосування у тканинній культурі мутанта ячменю D112 або А618. Тканинну культуру в оптимальному варіанті застосовують для регенерації рослин, які мають характеристики попередніх рослин ячменю, включаючи морфологічні та генетичні характеристики. Регенерованими клітинами у таких тканинних культурах можуть бути ембріони, протопласти, меристематичні клітини, калюс, пилок, пиляки і т.ін. Зрозуміло, що даний винахід забезпечує рослини ячменю, регенеровані з тканинних культур згідно з винаходом. В оптимальному варіанті втілення даний винахід включає солод, одержаний з ячмінних зерен з нульовим LOX-1. Даний винахід також стосується композицій сусла, одержаних з рослин ячменю з нульовим LOX-1 або їх частин, або з композицій солоду, одержаних з таких рослин ячменю. Винахід також охоплює напої, такі як пиво, вироблені з використанням або ячмінних зерен з нульовим LOX-1 згідно з даним винаходом, або солоду, одержаного з вищезгаданих зерен. 15 Крім того, винахід стосується рослинного продукту, одержаного з рослини ячменю з нульовим LOX-1 або її частини. Вищезгаданий рослинний продукт може бути будь-яким продуктом, одержаним в результаті переробки вищезгаданої рослини ячменю або її частини. В оптимальному варіанті вищезгаданий рослинний продукт вибирають з групи, яка складається з солоду, сусла, зброджених напоїв, таких як пиво, незброджених напоїв, харчових продуктів, таких як ячмінне борошно, та кормових продуктів. Мета даного винаходу також полягає у забезпеченні ячмінних зерен з нульовим LOX-1, які демонструють високий рівень стійкості до хвороб і які неможливо відрізнити від рослин ячменю дикого типу, або які мають навіть кращу стійкість до хвороб. Винахід також охоплює ячмінні зерна з нульовим LOX-1 та солод, одержаний з вищезгаданих зерен, причому як зерна, так і солод демонструють знижений рівень мікотоксинів. Крім того, даний винахід включає сорти ячменю з нульовим LOX-1 з підвищеною стійкістю до хвороб порівняно з рослиною дикого типу. Крім того, описується ячмінь з нульовим LOX-1, який має знижену стійкість до хвороб порівняно з рослиною дикого типу, за умови, що інші характеристики вищезгаданих рослин забезпечують переваги, які є більш важливими, ніж властивість зниженої стійкості до хвороб. Крім того, даний винахід забезпечує ячмінні зерна з нульовим LOX-1, корисні для створення похідних від шляху LOX ароматів, включаючи сполуки green note. Крім того, даний винахід забезпечує трансгенні рослини мутантів ячменю з нульовим LOX-1 D112 або А618, або рослини, які від нього походять, у яких включений(і) ген(и) забезпечують такі властивості, як резистентність до гербіцидів, стійкість до комах, стійкість до мікробних, грибкових або вірусних хвороб, підвищена поживна якість та придатність до промислового застосування. Ген може бути ендогенним геном ячменю або, в альтернативному варіанті, трансгеном, введеним шляхом застосування технологій генної інженерії. І нарешті, даний винахід забезпечує способи зниження активності LOX-1 шляхом застосування інгібіторів LOX-1. Рослинні продукти або продукти рослинного походження, включаючи напої та пиво, одержані вищезгаданими способами, можуть мати властивості, подібні до властивостей продуктів, одержаних з ячменю з нульовим LOX-1 як сировини. Ці та інші особливості, аспекти та переваги даного винаходу будуть краще зрозумілими після ознайомлення з представленими нижче визначеннями, описами, прикладами, формулою винаходу, а також переліками послідовностей та фігурами, які додаються. Визначення В описі, на представлених нижче фігурах та таблицях вжито кілька термінів. Для детального опису та формули винаходу, включаючи обсяг значень таких термінів, передбачено такі визначення: 89632 16 Вжита авторами форма однини може означати однину або множину, залежно від контексту, в якому її вжито. Термін "агрономічна властивість" описує фенотипічну властивість рослини, яка забезпечує характеристики або економічну цінність вищезгаданої рослини. До таких властивостей належать стійкість до хвороб, стійкість до комах, стійкість до вірусів, стійкість до нематод, стійкість до посухи, стійкість до засоленості ґрунту, врожайність, висота рослини, кількість днів до визрівання, класифікація зерен (тобто фракціонування зерен за розміром), вміст азоту в зернах і т.ін. Під "антисмисловою нуклеотидною послідовністю" слід розуміти послідовність, яка має зворотну орієнтацію відносно нормальної кодуючої 5'до-3' орієнтації цієї нуклеотидної послідовності. Будучи присутньою в рослинній клітині, антисмислова послідовність ДНК в оптимальному варіанті перешкоджає нормальній експресії нуклеотидної послідовності ендогенного гена і може переривати вироблення відповідного природного білка. Термін "ячмінь" по відношенню до процесу виробництва пива, зокрема, вжитий для опису процесу осолодження, означає ячмінні зерна. В інших випадках, якщо не вказано іншого, "ячмінь" означає рослину ячменю (Hordeum vulgare, L), включаючи будь-які сорти. Під "стійкістю до хвороб" слід розуміти уникнення рослинами симптомів хвороби, які є результатом взаємодії рослини з патогеном. Таким чином, створюється перешкода викликанню патогенами рослинних хвороб та пов'язаних з ними симптомів хвороб або, в альтернативному варіанті - симптомів хвороб. В альтернативному варіанті симптоми хвороб, викликані патогеном, мінімізуються або знижуються. "Злакова" рослина, як визначено в цій публікації, належить до родини Graminae, яку культивують, головним чином, через її насіння, що містить крохмаль. До злакових рослин належать, крім інших, ячмінь (Hordeum), пшениця (Triticum), рис (Oryza), кукурудза (Zea), жито (Secale), овес (Avena), сорго (Sorghum) та Triticale, гібрид жита та пшениці. Під "кодуванням" або "кодованим" у контексті конкретної нуклеїнової кислоти слід розуміти вміст інформації для перетворення на зазначений білок. Нуклеїнова кислота, яка кодує білок, може включати нетрансльовані послідовності (наприклад, інтрони) у межах трансльованих ділянок нуклеїнової кислоти, або може не мати таких проміжних нетрансльованих послідовностей (наприклад, у кДНК). Інформація, за допомогою якої кодується білок, зумовлюється застосуванням кодонів. Вжитий авторами термін "експресія" у контексті нуклеїнових кислот слід розуміти як транскрипцію та накопичення смислової мРНК або антисмислової РНК, яка походить від фрагменту нуклеїнової кислоти. Термін "експресія", вжитий у контексті білків, стосується перетворення мРНК на поліпептид. Під "смаковими молекулами" слід розуміти альдегіди та/або спирти, які виробляються і є складовими запаху та/або смаку в рослинах. Зок 17 рема, до смакових молекул належать деякі леткі спирти та альдегіди. Прикладами летких смакових молекул є, крім інших гексанал, (3Z)-гексенал, (2Е)-гексенал, (2Е)-гексенол, (3Z)-ноненал, (2Е)ноненал. Винахід може застосовуватися для регулювання рівня смакових молекул у рослинах. Термін "ген" означає сегмент ДНК, який бере участь у створенні поліпептидного ланцюга; він включає ділянки до та після кодуючої ділянки (промотор та термінатор). Еукаріотні гени перериваються білками, які ними кодуються, які складаються з екзонів, які перериваються інтронами. Після транскрипції в РНК інтрони видаляють шляхом сплайсингу для утворення зрілої інформаційної РНК (мРНК). "Місця сплайсингу" між екзонами зазвичай визначаються консенсусними послідовностями, які діють як сигнали для процесу сплайсингу, який складається з делеції інтрона з первинним РНК-транскриптом та з'єднання або злиття кінців решти РНК з будь-якого боку вирізаного інтрона. У деяких випадках альтернативні або відмінні моделі сплайсингу можуть утворювати різні білки з однієї витягнутої ДНК. Природний ген може називатись ендогенним геном. "Пригнічення експресії гена" є способом зміни експресії гена. Він стосується пригнічення експресії РНК, яке є механізмом посттранскрипційного пригнічення експресії гена, який зберігається серед різних організмів. Спосіб включає посттранскрипційне пригнічення експресії гена (PTGS) та РНК-інтерференцію (RNAi). PTGS являє собою пригнічення експресії ендогенних та екзогенних гомологічних генів. Хоча більшість прикладів PTGS стосуються впливу, викликаного послідовностями косупресії або експресією трансгенів в антисмисловій орієнтації, його також спостерігають у рослинах традиційних селекційних програм, наприклад, мутації Lgcl рису (Kusaba et al., 2003). Було виявлено, що ця мутація пригнічує експресію глутеліну через пригнічення експресії РНК, можливо, через делецію 3.5-kbp між двома дуже подібними генами глютеліну, який утворює хвіст-у-хвіст інвертований повтор, який може утворювати молекулу РНК з подвійним ланцюгом - а отже, ефективний індуктор пригнічення експресії РНК. Друга форма пригнічення експресії РНК є відомою як РНК-інтерференція (RNAi), при якій основною умовою є здатність РНК з подвійним ланцюгом до специфічного блокування експресії її гомологічного гена при ін'єкції у клітини або захопленні ними (Goenczy et al., 2000). Вжитий авторами термін "гетерологічний" по відношенню до нуклеїнової кислоти означає нуклеїнову кислоту, яка походить з іншого виду або, якщо з того самого виду, є значною мірою модифікованою порівняно з природною формою за складом та/або геномним локусом шляхом навмисного людського втручання. Вжитий авторами термін "пророщування" означає початок або відновлення росту ячмінного зерна у різних композиціях, наприклад, у нормальному ґрунті, в якому він росте у природі. Пророщування також може відбуватися у ґрунті у горщиках, розташованих у камерах для вирощування або інших подібних приміщеннях, або, наприклад, мо 89632 18 же відбуватися на вологому фільтрувальному папері, поміщеному у стандартні лабораторні чашки Петрі. Пророщування в цілому слід розуміти як таке, що включає гідратацію зерен, бубнявіння зерен та ріст зародків. До чинників навколишнього середовища, які впливають на пророщування, належить вологість, температура та рівень кисню. За розвитком коріння та паростків ведеться спостереження. "Green notes" є терміном, який описує леткі молекули смаку та аромату, присутнього у багатьох рослинах, і характеризується з органолептичної точки зору як свіжий зелений і трав'янистий. Ці молекули продукуються рослиною в результаті розпаду ліпідів та вільних жирних кислот, таких як лінолева кислота та ліноленова кислота. Вжитий авторами термін "виділений" означає, що матеріал є видаленим з первісного середовища. Наприклад, природний полінуклеотид або поліпептид, присутній у живому організмі, не є виділеним, але той же самий полінуклеотид або поліпептид, відокремлений від якогось або всіх співіснуючих матеріалів у природній системі, є виділеним. Такі полінуклеотиди можуть бути частиною вектора, і/або такі полінуклеотиди або поліпептиди можуть бути частиною композиції і все ж бути виділеними, якщо такий вектор або композиція не є частиною їх природного середовища. Термін "зерно" визначається як такий, що включає зернівку злаків, яка також відзначається наявністю внутрішнього насіння, квітковою лускою та плівкою. У більшості сортів ячменю квіткова луска та плівка прилипають до зернівки і складають частину зерна після обмолоту. Однак трапляються також і голі сорти ячменю. У них зернівка є вільною від квіткової луски та плівки і при молотінні відпадає, як у пшениці. "Визрівання зерна" або "розвиток зерна" стосується періоду, який починається з запліднення, у який засвоювані резерви, наприклад, цукри, олігосахариди, крохмаль, феноли, амінокислоти та білки, відкладаються, зі спрямуванням на вакуолі та без нього, у різних тканинах у зерні, наприклад, ендоспермі, тесті, алейроні та щитку зародка, що веде до збільшення розміру зерна, наповнення зерна і завершується висушуванням зерна. Термін "активність LOX-1" стосується ферментної активності ферменту LOX-1 ячменю. Зокрема, у контексті даного винаходу "активність LOX-1" являє собою каталізоване ферментом діоксигенування лінолевої кислоти до 9-HPODE. Навіть якщо фермент LOX-1 здатен каталізувати інші реакції, з точки зору визначення активності LOX-1 згідно з даним винаходом має розглядатися лише утворююча 9-HPODE активність. На Фіг.ЇВ показано біохімічний шлях, у якому лінолева кислота перетворюється на T2N. Термін "з низьким рівнем LOX" стосується присутності кількох однієї або кількох мутацій в одному або кількох ендогенних генах, які викликають часткову втрату функції зазначеного ферменту LOX, в оптимальному варіанті - стосовно ферментної активності, але не обмежуючись нею. Наприклад, рослини ячменю, описані у заявці РСТЯВ01/00207, опублікованій як WO 19 02/053721А1 від імені Douma et al., виробляють мутований фермент LOX-1, який має 10% залишкової активності порівняно з відповідним ферментом дикого типу. "З низьким рівнем LOX" по відношенню до рослини стосується рослини, яка має часткову втрату функції зазначеного ферменту LOX. "Осолодження" є особливою формою пророщування ячмінних зерен, яке відбувається за контрольованих навколишніх умов, включаючи, крім інших чани для осолоджувального вимочування та камери для пророщування. Згідно зі способом даного винаходу, осолодження починається під час та/або після замочування ячмінних зерен. Процес осолодження може бути зупинений шляхом висушування ячмінних зерен. Композицію солоду, одержану з ячменю з нульовим LOX-1, вважають такою, що містить солод з нульовим LOX-1, наприклад, чистий солод з нульовим LOX-1 або будь-яку суміш солоду, яка містить солод з нульовим LOX-1. "Затирання" являє собою інкубацію перемеленого солоду у воді. Затирання в оптимальному варіанті здійснюють при конкретній температурі і в конкретному об'ємі води. Температура та об'єм води мають значення, оскільки впливають на інтенсивність зниження активності ферменту, що походить від солоду, а отже, ступінь гідролізу крохмалю, що відбувається. Затирання може відбуватись у присутності домішок, які вважають такими, що містять будь-яке джерело вуглеводу, яке не є солодом, наприклад, ячмінний (включаючи ячмінь з нульовим LOX-1), кукурудзяний або рисовий додаток, який принципово використовують як додаткове джерело екстракту. Вимоги щодо переробки домішок у пивоварінні залежать від стану та типу додатку, який використовують, зокрема, температури желатинізації та розрідження крохмалю. Якщо температура желатинізації перевищує нормальну температуру оцукрювання солоду, то крохмаль желатинізується й розріджується перед додаванням до сусла. Термін "мутації" охоплює делеції, вставки, трансверсії та точкові мутації у кодуючих та некодуючих ділянках гена. Делеції можуть стосуватися всього гена або лише частини гена. Результатом точкових мутацій можуть бути стоп-кодони, мутації зі зсувом рамки генетичного коду або заміщення амінокислот. Соматичними мутаціями є мутації, які трапляються лише у певних клітинах або тканинах рослини і не успадковуються наступним поколінням. Термінальні мутації можуть міститись у будьякій клітині рослини і успадковуються. Термін "нульовий LOX" стосується присутності мутації в кодуючому LOX гені, яка викликає повну втрату функції кодованого ферменту LOX. Мутації, які виробляють кодони передчасної термінації (нонсенс-кодони) у гені, який кодує LOX, представляють лише один механізм, завдяки якому досягають повної втрати функції. Молекулярні способи досягнення повної втрати функції ферменту LOX включають створення мутацій, які викликають повну відсутність транскриптів для вищезгаданого ферменту або мутацій, які повністю інактивують кодований фермент. "Нульовий LOX" по відно 89632 20 шенню до рослини стосується рослини, яка має повну втрату функції зазначеного ферменту LOX. "Функціонально зв'язаний" є терміном, який застосовують у зв'язку з двома або більшою кількістю фрагментів нуклеїнової кислоти на одному полінуклеотиді, таким чином, щоб на функцію одного впливала функція іншого. Наприклад, промотор є функціонально зв'язаним з кодуючою послідовністю, якщо він здатен впливати на експресію цієї кодуючої послідовності, тобто кодуюча послідовність перебуває під транскрипційним контролем промотора. Кодуючі послідовності можуть бути функціонально зв'язаними з регуляторними послідовностями у смисловій або антисмисловій орієнтації. "PCR" або "полімеразна ланцюгова реакція" є загальновідомою серед спеціалістів у даній галузі як спосіб, який застосовують для ампліфікації конкретних сегментів ДНК (Патенти США №№4,683,195 та 4,800,159, видані Mullis et al.). "Рослина" або "рослинний матеріал" включає рослинні клітини, рослинні протопласти, тканинні культури рослинних клітин, з яких можуть бути регенеровані рослини ячменю, рослинний калюс та рослинні клітини, які є інтактними у рослинах або частинах рослин, таких як ембріони, пилок, насінні зачатки, квітки, зерна, листя, коріння, кінчики коренів, пиляки або будь-яка частина або продукт з рослини. Під терміном "рослинний продукт" слід розуміти продукт, який одержують в результаті обробки рослини або частини рослини. Вищезгаданий рослинний продукт, таким чином, може бути, наприклад, солодом, суслом, збродженим або незбродженим напоєм, харчовим або кормовим продуктом. Вжитий авторами термін "рекомбінантний" по відношенню до білка означає білок, який походить від чужорідного виду або, якщо походить з того самого виду, є значною мірою модифікованим порівняно з його природною формою у композиції шляхом навмисного людського втручання. "Транскрипт РНК" стосується продукту, який виникає в результаті Каталізованої РНКполімеразою транскрипції послідовності ДНК. Коли транскрипт РНК є ідеально комплементарною копією послідовності ДНК, він називається первинним транскриптом. Коли послідовність РНК одержують в результаті посттрансляційної обробки первинного транскрипту, вона називається зрілою РНК. Термін "інформаційна РНК" або "мРНК" стосується РНК, яка не має інтронів і яка може бути перетворена клітиною на білки. Термін "кДНК" стосується ДНК, яка є комплементарною матриці мРНК і походить від неї. КДНК може бути одноланцюговою або перетвореною на дволанцюгову форму через застосування, наприклад, фрагмент Кленова ДНК-полімерази І. "Смислова РНК" стосується транскрипту РНК, який включає мРНК і, таким чином, може бути перетворений клітиною на поліпептид. "Антисмислова РНК" стосується транскрипту РНК, який є комплементарним усьому заданому первинному транскриптові або мРНК або їх частині і блокує експресію гена-мішені. Комплементарність антисмислової РНК може існувати до 21 будь-якої частини конкретної нуклеотидної послідовності, тобто у 5' некодуючій послідовності, 3' некодуючій послідовності, інтронах або кодуючій послідовності білка. "Функціональна РНК" стосується смислової РНК, антисмислової РНК або іншої РНК, яка не може бути перетворена на білок, але все ж має вплив на клітинні процеси. Якщо немає іншого визначення, "T2N" означає вільну форму T2N. Під терміном "потенціал T2N" слід розуміти хімічні речовини, які є здатними вивільнювати T2N або бути перетвореними на T2N у процесі однієї або кількох реакцій. Потенціал T2N може бути виміряний як концентрація T2N у розчині, наприклад, у суслі або пиві, після інкубації (наприклад, протягом 2год.) при підвищеній температурі (наприклад, 100°С) та низькій кислотності (наприклад, рН4,0). Ця обробка зразка викликає вивільнення T2N з потенціалу T2N, наприклад, з "адуктів T2N", тобто T2N, кон'югованих з однією або кількома речовинами, включаючи, крім інших, білок (білки), сульфіт, клітинний дебрис, стінки клітин і т.ін. Взагалі, адукти T2N самі по собі не відчуваються людиною як сторонні присмаки. Однак T2N, вивільнений з вищезгаданих адуктів T2N, наприклад, під дією нагрівання або кислоти, можуть викликати сторонній присмак. "Тканинна культура" означає композицію, яка включає виділені клітини одного або різних типів або сукупність таких клітин, організованих у частини рослини, наприклад, протопласти, калюс, ембріони, пилок, пиляки і т.ін. "Перетворення" означає включення ДНК в організм таким чином, щоб ДНК підтримувалась або як позахромосомний елемент (без інтеграції та стійкого успадкування), або як хромосомний компонент (генетично стійке успадкування). Якщо не вказано іншого, застосований авторами спосіб перетворення Е. соІі являє собою СаСІ2-спосіб (Sambrook and Russel, supra). Для перетворення ячменю може бути здійснене опосередковане Agrobacterium перетворення, в цілому, як описано у публікаціях Tingay et al. (1997) та Wang et al. (2001), за винятком того, що як хазяїна використовують іншу культуру, таку як культура Golden Promise. "Трансген" є геном, який було включено у геном із застосуванням процедури перетворення. Вжитий авторами термін "трансгенний" включає посилання на клітину, яку було модифіковано шляхом включення гетерологічної нуклеїнової кислоти, або клітину, яка, походить від модифікованої таким чином клітини. Таким чином, наприклад, трансгенні клітини експресують гени, які не містяться в ідентичній формі у межах природної форми клітини, або експресують природні гени, які за інших умов експресуються з відхиленнями від норми, недостатньо експресуються або не експресуються взагалі в результаті навмисного людського втручання. Вжитий авторами термін "трансгенний" по відношенню до рослин, зокрема, рослин ячменю, не включає зміну клітини способами традиційної селекції рослин, наприклад, викликаного NaN3 мутагенезу, та природних подій, таких як ті, що відбуваються без навмисного людського втручання. 89632 22 Термін "рослина ячменю дикого типу" стосується традиційної рослини ячменю, в оптимальному варіанті - рослини ячменю, від якої походять рослини ячменю згідно з винаходом, тобто батьківської рослини. В одному з оптимальних варіантів втілення винаходу "рослину ячменю дикого типу" є вибраною з групи, яка складається з таких сортів, як Celeste, Lux, Prestige, Saloon та Neruda. У ще кращому варіанті "рослина ячменю дикого типу" є культурою Barke. Культури ячменю дикого типу або їх насіння можна придбати, наприклад, у компаній, які зазвичай займаються виробництвом насіння. Більш повне розуміння винаходу забезпечують представлений нижче детальний опис та супровідний Список послідовностей (зведений у Таблиці 9), який становить частину цієї заявки. У вищезгаданій таблиці представлено списки описаних авторами нуклеїнових кислот та поліпептидів, позначення клонів кДНК, які включають фрагменти нуклеїнових кислот, які кодують поліпептиди, які повністю представляють ці поліпептиди або їх суттєву частину, та відповідні позначення [SEQ ID NO:]. Описи послідовностей та Список послідовностей, які додаються до цього опису, відповідають правилам, які регулюють розкриття нуклеотидних та/або амінокислотних послідовностей у патентних заявках. Список послідовностей містить однолітерний код для нуклеотидних або амінокислотних послідовностей, визначений згідно зі стандартизованими рекомендаціями (Cornish-Bowden, 1985; Спільна комісія з біохімічної номенклатури IUРАС-IUВ, 1984), які є включеними авторами шляхом посилання. Символи та формат, застосовані для даних щодо нуклеотидних або амінокислотних послідовностей, відповідають правилам, які регулюють розкриття послідовностей у патентних заявках. Фіг.1 розділено на три блок-схеми А, В та С. Фіг.1А показує, яким чином можуть поширюватися NaN3-мутагенізовані ячмінні зерна. Зерна покоління М0 вирощують у рослини, які виробляють зерна покоління М1. Вони можуть висіватися й розвиватись у рослини М1, які виробляють нові зерна покоління М2. Далі рослини М2 виростають і виробляють зерна покоління М3, які збирають і застосовують для аналізів з відбором. Насіння М3 також висівають і квітки відповідних рослин використовують для схрещування для одержання рослин покоління М4. Фіг.1В спрощено показує, яким чином діє біохімічний шлях LOX для розпаду лінолевої кислоти, зрештою забезпечуючи T2N. Фіг.1С пояснює, яким чином лінолева кислота може бути перетворена на відповідну 9-гіперперокси-кислоту (9-HPODE) під дією LOX-1, з наступними ферментними перетвореннями синтазою епоксиспирту та епоксидною гідролазою на 9,12,13-тригідрокси-10октадеценову кислоту (9,12,13-ТНОЕ). Фіг.2 є графічним порівнянням загальної активності LOX, виміряної в екстрактах зародків сорту Barke, мутант D112, і в контрольному зразку, який включає інактивований нагріванням екстракт ембріонів сорту Barke. Фіг.3 показує графічне порівняння загальної активності LOX, виміряної в екстрактах зародків 23 мутанта А618, сорт Neruda, і в контрольному зразку, який включає інактивований нагріванням екстракт ембріонів сорту Barke. Фіг.4 показує порівняння загальної активності LOX, виміряної у зернах 12 окремих ліній потомства М4 мутанта D112. Для порівняння брали активність контрольних зразків, які складалися з екстрактів зерен сорту Barke та інактивованих нагріванням екстрактів зерен сорту Barke. Фіг.5 показує результати аналізів загальної активності LOX у 90 окремих екстрактах зерен ліній потомства М5 мутанта D112. Для порівняння брали активність контрольних екстрактів зерен сорту Barke та інактивованих нагріванням екстрактів зерен сорту Barke. Фіг.6 стисло представляє порівняння загальної активності LOX, виміряної у 40 окремих екстрактах зерен ліній потомства М4 мутанта А618. Для порівняння брали активність контрольних зразків з екстрактами зерен сорту Barke та інактивованих нагріванням екстрактів зерен сорту Barke. Фіг.7 складається з двох окремих імуноблотаналізів, які показують, що імунореактивний білок LOX-1 не може бути виявлений в екстрактах зерен мутанта D112, покоління М3. Кожен імуноблотаналіз проводили з застосуванням як зонда антитіла до ячменю LOX-1, і зразки складалися з екстрактів клітин Е. Соlі, які експресували рекомбінантний LOX-1 (смуга 1), екстрактів зерен сорту Vintage (смуга 2), мутантної лінії G (смуга 3 та смуга 7), сорт Barke (смуга 6 та смуга 8) та окремих ліній мутанта D112, покоління М3 (смуги 4-5 та 916). Позначено позицію імунореактивного білка LOX-1. Фіг.8 показує два окремі імуноблот-аналізи з детальним показом відсутності LOX-1 в екстрактах зерен мутанта А618, покоління М3 та М4. Кожен імуноблот-аналіз проводили з застосуванням як зонда антитіла до ячменю LOX-1, і зразки складалися з екстрактів зерен мутанта лінії G (смуга 1), сорт Neruda (смуга 6 та смуга 16). Екстракти випадково вибраних зерен М3 та М4, які не проходили процедуру відбору на LOX, відокремлювалися у смугах 2-5 та 8-12, відповідно; усі ці екстракти містили імунореактивний білок LOX-1. Фенотип екстракту зерен мутанта А618 з нульовим LOX-1, покоління М3 (смуга 7), успадковувався в окремих лініях потомства М4 мутанта А618-82 (смуги 8-12). Позначено позицію імунореактивного білка LOX-1. Фіг.9 схематично пояснює генетику програми зворотного схрещування для мутанта D112 сорту Prestige. Властивість LOX-1 дикого типу позначено як NN, а властивість мутанта з нульовим LOX-1 позначено як пп. Рослини, які мають підкреслені генотипи, піддають схрещуванню. Фіг.10 пояснює сім окремих імуноблот-аналізів, кожен з яких проводили з застосуванням як зонда антитіла до ячменю LOX-1. Імуноблот-аналізи показують присутність або відсутність імунореактивного білка LOX-1 у зернах окремих рослин першого покоління зворотного схрещування мутанта D112 з сортом Prestige (смуги 1-6 та смуги 9-14) і присутність або відсутність імунореактивного білка LOX-1 у зернах другого покоління зворотного схрещування мутанта D112 з сортом Prestige (сму 89632 24 ги 17-22, смуги 25-30, смуги 33-38, смуги 41-45 та смуги 48-52). Контрольні екстракти зерен мутанта D112, які не мають імунореактивного LOX-1 (смуги 7, 15, 23, 31, 39, 46, 53) та сорт Prestige, який містить імунореактивний LOX-1 (смуги 8, 16, 24, 32, 40, 47, 54), застосовували як контрольні зразки. Позначено позицію імунореактивного білка LOX-1. Фіг.11 є спрощеним схематичним показом процесу виробництва пива без застосування домішок, але з включенням вимочування ячмінних зерен (1), осолодження (2), гарячого пічного висушування (3), перемелювання висушеного солоду (4), затирання (5), фільтрації (6), варіння сусла у присутності доданого хмелю (7), ферментації у присутності дріжджів (8), визрівання пива (9), фільтрації пива (10), поміщення у тару, включаючи, крім іншого, розливання у пляшки, банки і т.ін. (11) та етикетування (12). Окремі процеси можуть бути згруповані у розділи, які включають виробництво солоду (1-3), виробництво сусла (4-7), ферментацію (8-9) та приготування готового пива (10-12). Фіг.12 показує характеристики пива, виробленого з застосуванням солоду, одержаного з ячменю з нульовим LOX-1, мутант D112. Фіг.12А пояснює накопичення вільного T2N під час прискореного старіння протягом 4 тижнів при 37°С. Альдегід вимірювали у пиві, виробленому з солоду з мутанта D112 з нульовим LOX-1 (▲), та контрольного солоду сорту Barke (●). Рівень смакового порогу для T2N у пиві становить приблизно 0,05 ppb. Фіг.12В дає графічне представлення даних, зібраних після оцінки дегустаційною комісією по окремих смакових характеристиках пива, яке інкубували при 20°С протягом 12 місяців. Пиво виготовляли з солоду, одержаного або з ячменю сорту Barke (темні стовпчики), або з мутанта D112 з нульовим LOX-1 (світлі стовпчики). Фіг.13 показує хроматограми HPLC-аналізів, які застосовували для оцінки утворення 9- та 13HPODE у тканинах ячменю. Рівень HPODE аналізували шляхом вимірювання оптичної густини при 234нм, з результатами, представленими у тисячних одиницях оптичної густини (mAU). Піки профілів елюювання, які відповідають 9-HPODE тa 13HPODE. позначено стрілками. Фіг.13А показує хроматограму стандартів 9-HPODE та 13-HPODE. Фіг.13В є хроматограмою HPODE, утворених в екстрактах, одержаних зі зрілих ембріонів сорту Barke. Фіг.13С є хроматограмою HPODE, утворених в екстрактах, одержаних зі зрілих ембріонів зерен з низьким рівнем LOX. Фіг.13D є хроматограмою HPODE, утворених в екстрактах зрілих ембріонів мутанта D112 з нульовим LOX-1. Фіг.14 показує хроматограми HPLC-аналізів, які застосовували для оцінки утворення 9- та 13HPODE у солоді. Рівень вищезгаданих HPODE аналізували шляхом вимірювання оптичної густини при 234нм, з результатами, представленими у тисячних одиницях оптичної густини (mAU). Піки профілів елюювання, які відповідають 9-HPODE та 13-HPODE, позначено стрілками. Фіг.14А показує хроматограму стандартів 9-HPODE та 13-HPODE. Піки хроматограми, які відповідають 9-HPODE та 13-HPODE, позначено стрілками. Фіг.14В є хроматограмою HPODE, утворених в екстрактах солоду 25 з сорту Barke. Фіг.14С є хроматограмою HPODE, утворених в екстрактах солоду з ячменю з низьким рівнем LOX. Фіг.14D є хроматограмою HPODE, утворених в екстрактах солоду з мутанта D112 з нульовим LOX-1. Фіг.15 є картою, яка показує організацію гена для LOX-1 ячменю, розташованого між старткодоном (ATG) та стоп-кодоном (ТАА). Схематичне зображення послідовності, яка має довжину 4,165bр, показує 7 екзонів (темні клітинки) та 6 інтронів (лінії). Позицію мутацій, розпізнаних у гені, який кодує LOX-1, тобто специфічних для мутантної лінії G (з низьким рівнем LOX), мутанта А618 та мутанта D112, позначено стрілками. Фіг.16 показує прогнозовані молекулярні розбіжності, пов'язані з геном для LOX-1, рослин ячменю дикого типу, мутанта А618 та мутанта D112. Інформація, вказана у колонках з позначенням "Результат," "Довжина в амінокислотах" та "Маса у кДа" є прогнозованою на основі послідовності ДНК. Фіг.17 показує способи, які застосовують для здійснення RT-PCR-аналізу мутанта та перевірки транскрипту, пов'язаного з геном ячменю, який кодує LOX-1. У частині А схематично показано принцип виявлення шляхом RT-PCR специфічного транскрипту для гена, який кодує LOX-1 в ембріонах, які розвиваються, сорту Vintage та мутантній лінії G з низьким рівнем LOX-1. Праймери складалися з FL821 [SEQ ID NO:11] та FL852 [SEQ ID NO:12], які комплементарно з'єднуються в екзонах, які прилягають до інтрона завдовжки у 83 bр 5; вказуються розбіжності продукту PCR з застосуванням матриць геномної ДНК або мРНК. У частині В показано результат RT-PCR-аналізу агарозного гелю, в якому основну увагу було приділено виявленню специфічного транскрипту, пов'язаного з геном, який кодує LOX-1 в ембріонах, які розвиваються, ячменю сорту Vintage та мутантної лінії G. Смуги 1 та 5 містили фрагменти маркера, а смуги 2, 3 та 4 містили продукти PCR, одержані з тканин ембріонів сорту Vintage через 20, 40 та 60 днів після цвітіння (DAF), відповідно. Смуги 6, 7 та 8 містять продукти, одержані з тканин ембріонів мутантної лінії G через 20, 40 та 60 DAF, відповідно. У частині С смуги 1-5 показують результат експерименту, подібний до того, який детально описано для смуг 1-5 у частині В, а смуги 6, 7 та 8 містили продукти, одержані шляхом виявлення за допомогою RT-PCR специфічного до ембріона транскрипту гена мутанта D112 для LOX-1 через 20, 40 та 60 DAF, відповідно. У частині D показано електроферограму, отриману в результаті реакції секвенування RT-PCR-фрагмента, специфічного до гена, який кодує LOX-1. Аналіз послідовності виявив, що РНК, яка була мішенню RT-PCR, не містила ДНК. Чорний трикутник позначає місце сплайсингу, вказуючи на правильний сплайсинг транскрипту. Фіг.18 детально показує результати виявлення за допомогою SNP мутанта ячменю D112. В основу аналізу було покладено створення конкретної моделі фрагмента PCR з застосуванням двох реакційних комплектів для PCR для кожного зразка, як схематично пояснюється у частині А (комплект 89632 26 праймера 1 складається з FL820 [SEQ ID NO:13] та праймера FL823 [SEQ ID NO:15], і комплект праймера 2 складається з FL820 [SEQ ID NO:13] та FL825 [SEQ ID NO:14]). У частині В показано результат аналізу моделі PCR елітного селекційного матеріалу. Геномну ДНК рослин піддавали PCR-аналізам. Результати показано у смугах 2-3 (рослина 1), 4-5 (рослина 2), 6-7, (рослина 3), 8-9 (рослина 4), 10-11 (рослина 5), 12-13 (рослина 6), 14-15 (рослина 7), 16-17 (рослина 8) та 18-19 (рослина 9) з застосуванням комбінації праймера 1 (смуги з парними номерами) або комбінація праймера 2 (смуги з непарними номерами). Порівняння моделі бендингу з показаною у частині А виявило, що рослини 1, 2, 4, 5, 7 та 8 є гомозиготними мутантами, тоді як генотип рослин 3, 6 та 9 може бути класифікований як гомозиготний дикого типу. Маркерна ДНК відокремлювалася у смугах 1 та 20. Фіг.19 демонструє принцип складного SNPаналізу зразків ячменю, які містять матеріал мутанта G або мутанта D112. В аналізі застосовували складні реакції PCR, таким чином, щоб довжина ампліфікованого фрагмента могла бути пов'язаною з генотипом матеріалу, який додається. Ампліфікація фрагмента 370 bр вказує, що зразок солоду містить матеріал, який походить з мутантної лінії G, а ампліфікація фрагмента 166 bр вказує на присутність матеріалу, який походить з мутанта D112. Панель А є схематичним зображенням, яке детально пояснює, яким чином конкретні пари праймерів, кожна з яких має один праймер, який містить послідовність, яка є специфічною до даного мутанта (зірочка; для мутантної лінії G нуклеотид номер 2279 у геномному клоні для LOX-1, і для мутанта D112 позиція 3574). Комбінацію праймера FL918 [SEQ ID NO:16] та FL920 [SEQ ID NO:17] використовували для виявлення специфічної до мутантної лінії G мутації, а FL820 [SEQ ID NO:13] та FL823 [SEQ ID NO:15] застосовували для виявлення специфічної для мутанта D112 зміни основи. У частині В показано, яким чином відносна кількість специфічного до мутанта матеріалу (смуги 2-7: мутантна лінія G; смуги 8-13: мутант D112) у зразках може посилювати синтез конкретного фрагмента PCR (смуги 2 та 8: без додавання мутантного матеріалу; смуги 3 та 9: 20% з додаванням мутантного матеріалу; смуги 4 та 10: 40% з додаванням мутантного матеріалу; смуги 5 та 11: 60% з додаванням мутантного матеріалу; смуги 6 та 12: 80% з додаванням мутантного матеріалу; смуги 7 та 13: 100% мутантного матеріалу). Смуга 1 складалася з фрагментів маркера. Фіг.20 представляє результат SDS-PAGE очищеного афінним способом His-міченого LOX-1 з клітин Е. соlі, перетворених векторною плазмідою рЕТ19b (смуги 2-5), експресійною плазмідою pETL1 (смуги 6-10) та експресійною плазмідою pETL2 (смуги 11-15). Аналізові піддавали білки з фракцій, які включають незв'язані білки (смуги 2, 6, 11); перший промив (смуги 3, 7, 12); другий промив (смуги 4, 8, 13); перший елюат (смуги 5, 9, 14); та другий елюат (смуги 10 та 15). Верхня стрілка вказує позицію рекомбінантного LOX-1 (що відповідає LOX-1 дикого типу), а нижня стрілка вказує позицію зрізаного, рекомбінантного LOX-1 (який відпо 27 відає LOX-1 у мутанті ячменю D112). Смуга 1 включала окремі маркерні білки. Фіг.21 показує плазмідні вставки для перетворення ячменю. У частині А пояснюється експресійна касета, яка складається з промотора убіквітин-1 та інтрона 1 кукурудзи (під загальною назвою UBI-промотор), що спрямовує конститутивну експресію bar-тет (BAR), який кодує селектабельний маркер фосфінотрицин ацетилтрансферазу. Термінація транскрипції забезпечується термінаторною послідовністю NOS (N). У частині В пояснюється експресійна касета, яка складається з вищезгаданого UBI-промотора, що у даному разі спрямовує конститутивну експресію послідовності кДНК ячменю для LOX-1 у смисловій або антисмисловій орієнтації. У частині С пояснюється експресійна касета, яка складається з UBI-промотора, що спрямовує конститутивну експресію "шпилькової" послідовності, яка містить інтрон, у якій послідовність інтрона 1 гена Arabidopsis для FAD2 інтрона 1 (Int) десатурази жирної кислоти, з боків має смислову гілку ( ) та антисмислову гілку ( ) фрагмента у приблизно 200 bр гена для LOX-1. Термінація транскрипції забезпечується NOS термінаторною послідовністю (N). Для створення рослин ячменю, які виявляють косупресію гена, який кодує LOX-1, застосовують суміші плазмід, які включають однакову кількість експресійних плазмід, які включають вставки, детально вказані у частинах А та В. Для створення рослин ячменю, які виявляють повне пригнічення експресії гена, який кодує LOX-1, застосовують суміші, які включають однакову кількість експресійних плазмід, які включають ці вставки, вказані у частинах А іаС. Фіг.22 детально показує результати експериментів, які стосуються інгібіторів, що знижують активність LOX-1. У частині А показано електрофоретичне відокремлення білків у 10% SDSPAGE, з окремими смугами, які пояснюють результат поетапного очищення His-міченого LOX-1 з клітин Е. соlі (пор. Приклад 18). Білки у необроблених екстрактах трансформантів з вектором рЕТ19b та плазмідою pETL1 показано у смузі 1 та смузі 2, відповідно, а смуги 3-5 містять окремі білки розчинів промивів 2, 3 та 4. Аліквотні кількості зразків по 3мкл з 1мл елюатів колонки для афінної хроматографії відокремлювалися у смузі 6 (елюат 1), смузі 7 (елюат 2), смузі 8 (елюат 3) та смузі 9 (елюат 4). Горизонтальна стрілка вказує позицію рекомбінантного LOX-1. Аліквоти LOX-1 з елюату 2 застосовували для досліджень інгібітора, представлених у загальних рисах у частині В. У даному разі залишкову активність LOX-1 вимірювали після інкубації з 5мкл LOX-1 (елюат 2) у присутності інгібітора, або NDGA (●), або октилгалату (▲). Фіг.23 детально показує рівень T2N у зразках сусла, одержаних в результаті затирання без додавання інгібітора (світлі стовпчики) або у присутності 0,5мМ інгібітора LOX-1 октилгалату (темні стовпчики). Зразки, взяті після затирання (37°С) або після варіння (варене сусло), включали сусло, одержане від затирання з солодом ячменю сорту Barke або мутанта ячменю D112 з нульовим LOX1. 89632 28 Для зрозумілості опису, але не для обмеження його обсягу детальний опис винаходу розділено на такі підрозділи: (і) Рослина ячменю; (іі) Одержання ячменю з нульовим LOX-1; (Ні) Композиція; (iv) Хімічний мутагенез; (ν) Вибір мутантів ячменю; (vi) Селекція рослин; (vii) Схрещування ячменю; (viii) Ферменти LOX; (їх) продукти шляху LOX; (х) Потенціал T2N; (хі) Стійкість до хвороб; (xii) Мікотоксини; (xiii) Ароматизатори; (xiv) Гетерологічна експресія генів, які кодують LOX; (xv) Інгібітори LOX. 1. Рослина ячменю "Дикий ячмінь", Hordeum vulgare вв. spontaneum, вважається попередником культивованих у даний час форм ячменю. Тривалий час вважалося, що застосування цього злаку є ключем для пояснення початку культивування зернових у Fertile Crescent. Те, що людина могла збирати зернові протягом усього тривалого літнього сезону, забезпечило передумови для їх одомашнення робило їх окультурення. Ранні культурні сорти, очевидно, були генетично дуже різноманітними, що підтверджується дослідженням дикого ячменю з Ізраїлю, Туреччини та Ірану (Nevo, 1992). Було виявлено, що дикі популяції ячменю значною мірою відрізняються між собою за алельним вмістом. Зі 127 апелів у 27 спільних локусах 65 алелів виявилися унікальними, тобто вони траплялися лише в одній країні. Вважається, що перехід ячменю від дикого до культурного стану збігся з радикальною зміною частоти алелів у багатьох локусах. Рідкісні алелі та нові мутації стали вигідно використовуватися для відбору фермерами, які швидко закріпили нові властивості в окультурених популяціях рослин, які отримали назву "ячмінних ландрасів". Генетично вони більш схожі на сучасні культури, ніж дикий ячмінь, і являють собою джерело корисних алелів для селекції (Ellis et al., 1998). До кінця дев'ятнадцятого сторіччя ячмінні ландраси існували як високогетерогенні суміші інбредних ліній та гібридних сегрегатів, включаючи деякі рослини, одержані від випадкового схрещування у більш ранніх поколіннях. Більшість ландрасів з розвитком землеробства було замінено на чисті лінії культур. Ландраси, які залишилися, характеризуються проміжним або високим рівнем генетичної різноманітності. Спочатку "сучасні ячмінні культури" відбиралися з-поміж ландрасів. Згодом їх стали одержувати в результаті послідовних циклів схрещування між стійкими чистими лініями, наприклад, такими, що походили з різних географічних джерел. Зрештою це призвело до помітного звуження генетичної бази у багатьох, а можливо, й усіх сучасних сільськогосподарських культурах. Порівняно з ландрасами, сучасні ячмінні культури мають численні 29 поліпшені властивості (Nevo, 1992 and von Bothmer et al., 2003), до яких, крім інших, належать: (і) Вкриті та голі зерна (іі) Спокій насіння (iiі) Стійкість до хвороб (iv) Пропорції лізину та інших амінокислот (ν) Вміст білка (vi) Вміст азоту (vii) Вуглеводний склад (viii) Структура гордеїну Таким чином, в одному варіанті втілення винаходу рослина ячменю є сучасною культурою ячменю, модифікованою таким чином, щоб включати менше 1% активності LOX-1 відповідного дикого типу рослину ячменю. Таким чином у цьому варіанті втілення перевагу віддають рослині ячменю, яка не є ячмінним ландрасом. Даний винахід стосується рослин ячменю та їх частин, які включають менше, ніж 5%, в оптимальному варіанті - менше, ніж 4%, у ще кращому варіанті - менше, ніж 3%, у ще кращому варіанті - менше, ніж 2%, у ще кращому варіанті - менше, ніж 1 % активності LOX-1 рослини ячменю дикого типу. Рослини ячменю згідно з винаходом, які включають менше, ніж 1% активності LOX-1, також називаються авторами "рослинами ячменю з нульовим LOX-1." Рослина ячменю може перебувати у будь-якій прийнятній формі. Наприклад, рослина ячменю згідно з винаходом може бути життєздатною рослиною ячменю, висушеною рослиною, гомогенізованою рослиною, такою як перемелені ячмінні зерна. Рослина може бути зрілою рослиною, ембріоном, пророщеним зерном, осолодженим зерном і т.ін. Частини рослин ячменю можуть бути будьякими прийнятними частинами рослини, такими як зерна, ембріони, листя, стебла, коріння, квітки або їх фрагменти. Фрагментами можуть бути, наприклад, вирізані частини зерен, ембріонів, листя, стебел, коріння або квіток. Частинами рослин ячменю також можуть бути фрагменти гомогенату або перемеленої рослини ячменю або зерна. В одному варіанті втілення винаходу частинами рослин ячменю можуть бути клітини вищезгаданої рослини ячменю, в оптимальному варіанті життєздатні клітини, які можуть поширюватись у тканинних культурах in vitro. В оптимальному варіанті втілення винаходу рослини ячменю з нульовим LOX-1 включають менше, ніж 5%, в оптимальному варіанті - менше, ніж 3%, у ще кращому варіанті - менше, ніж 1%, в оптимальному варіанті - менше, ніж 0,5%, у ще кращому варіанті - менше, ніж 0,1% активності рослини ячменю дикого типу. Активність може визначатися будь-яким прийнятним способом, однак в оптимальному варіанті активність визначають, застосовуючи спосіб згідно з представленим нижче Прикладом 1. В одному з найкращих варіантів втілення винаходу рослини ячменю з нульовим LOX-1 практично не мають активності LOX-1, у ще кращому варіанті - зовсім не мають активності LOX-1. "Практично не мають активності LOX-1" означає відсутність виявленої активності LOX-1 89632 30 при застосуванні аналізів активності LOX-1, як описано авторами нижче. Майже відсутня активність LOX-1 ячменю з нульовим LOX-1, наприклад, може бути результатом того, що вищезгаданий ячмінь включає білок LOX-1 з неправильною функцією, такий як мутантний білок LOX-1. Однак ячмінь з нульовим LOX-1 включає лише дуже малу кількість, у ще кращому варіанті - зовсім не включає білка LOX-1, наприклад, менше, ніж 5%, в оптимальному варіанті менше, ніж 3%, у ще кращому варіанті - менше, ніж 1%, в оптимальному варіанті - менше, ніж 0,5%, у ще кращому варіанті - менше, ніж 0,1% білка LOX-1 порівняно з рослиною ячменю дикого типу. У ще кращому варіанті ячмінь з нульовим LOX-1 по суті не включає білка LOX-1, у найкращому варіанті - взагалі не включає білка LOX-1. "По суті не включає білка LOX-1" означає відсутність білка LOX-1, що піддається виявленню. Білок LOX-1 може бути виявлений будь-яким прийнятним способом, відомим спеціалістам у даній галузі, однак в оптимальному варіанті білок виявляють способом, згідно з яким білок LOX-1 виявляють за допомогою антитіл, специфічних до LOX-1. Вищезгаданими способами можуть бути, наприклад, вестерн-блотинг або ELISA. Вищезгадані специфічні антитіла можуть бути моноклональними або поліклональними, однак в оптимальному варіанті вищезгадані антитіла є поліклональними антитілами, які розпізнають кілька різних епітопів у межах білка LOX-1. Білок LOX-1 також може бути виявлений непрямо, наприклад, способами визначення активності LOX-1, способами виявлення мутацій у гені, який кодує LOX-1, або способами виявлення експресії гена LOX-1. Мутації у гені, який кодує LOX-1, можуть бути виявлені, наприклад, шляхом секвенування вищезгаданого гена. Експресія гена, який кодує LOX-1, можуть бути виявлені, наприклад, шляхом нозерн-блотингу або RT-PCR. В одному з оптимальних варіантів втілення винаходу білок LOX-1 виявляють, застосовуючи способи, викладені у Прикладі 4 даної публікації. Термін "білок LOX-1" охоплює білок LOX-1 повної довжини ячменю, як викладено у [SEQ ID NO:3] або [SEQ ID NO:7], або його функціональний гомолог. Активна ділянка LOX-1 розташовується у С-кінцевій частині LOX-1. Зокрема, ділянка, яка перебуває між амінокислотними залишками 520862 або її частини, які стосуються активності LOX1. Відповідно, в одному варіанті втілення ячмінь з нульовим LOX-1 в оптимальному варіанті включає ген, який кодує мутантну форму LOX-1, яка не має деяких або всіх амінокислот 520-862 LOX-1, Вищезгаданий мутант LOX-1 також може не мати інших амінокислотних залишків, яки є присутніми у LOX1 дикого типу. Відповідно, ячмінь з нульовим LOX-1 може включати зрізану форму LOX-1, яка не є функціональною, таку як N-кінцева або С-кінцева зрізана форма. В оптимальному варіанті вищезгадана зрізана форма включає не більше, ніж 800, у ще кращому варіанті - не більше, ніж 750, у ще кращому варіанті - не більше, ніж 700, у ще кращому варіанті - не більше, ніж 690, у ще кращому варіа 31 нті - не більше, ніж 680, у ще кращому варіанті - не більше, ніж 670 послідовних амінокислот LOX-1, наприклад, не більше, ніж 665, наприклад, не більше, ніж 650, наприклад, не більше, ніж 600, наприклад, не більше, ніж 550, наприклад, не більше, ніж 500, наприклад, не більше, ніж 450, наприклад, не більше, ніж 425, наприклад, не більше, ніж 399 послідовних амінокислот LOX-1 із [SEQ ID NO:3]. В оптимальному варіанті вищезгадана зрізана форма включає лише N-кінцевий фрагмент LOX-1. Отже, в оптимальному варіанті вищезгадана зрізана форма включає щонайбільше 800, у ще кращому варіанті - щонайбільше 750, у ще кращому варіанті - щонайбільше 700, у ще кращому варіанті - щонайбільше 690, у ще кращому варіанті - щонайбільше 680, у ще кращому варіанті - щонайбільше 670, у ще кращому варіанті - щонайбільше 665 N-кінцевих амінокислот із [SEQ ID NO:3], наприклад, не більше, ніж 665, наприклад, не більше, ніж 650, наприклад, не більше, ніж 600, наприклад, щонайбільше 550, наприклад, щонайбільше 500, наприклад, щонайбільше 450, наприклад, щонайбільше 425, наприклад, щонайбільше 399 Nкінцевих амінокислот із [SEQ ID NO:3]. У варіанті втілення, якому віддають найбільшу перевагу, зрізана форма може складатися з амінокислот 1-665 із [SEQ ID NO:3]. В оптимальному варіанті втілення винаходу рослина ячменю включає ген, який транскрибується в мРНК, що кодує LOX-1, причому вищезгадана мРНК включає антисмисловий кодон або стопкодон перед стоп-кодоном мРНК LOX-1 дикого типу. Такий антисмисловий кодон у даному описі позначено як передчасний нонсенс-кодон. В оптимальному варіанті всі гени, які транскрибуються в мРНК, що кодує LOX-1 вищезгаданої рослини, включають передчасний нонсенс-кодон або стопкодон. Нонсенс-кодон або стоп-кодон в оптимальному варіанті розташовується щонайбільше через 800, у ще кращому варіанті - щонайбільше через 750, у ще кращому варіанті - щонайбільше через 700, у ще кращому варіанті - щонайбільше через 690, у ще кращому варіанті - щонайбільше через 680, у ще кращому варіанті - щонайбільше через 670, у ще кращому варіанті - щонайбільше через 665 кодонів після старт-кодону. Послідовність геномної ДНК дикого типу, яка кодує LOX-1, представлено у [SEQ ID NO:1] або [SEQ ID NO:5]. В одному з оптимальних варіантів втілення рослина ячменю включає ген, який кодує LOX-1, причому pre-мРНК, транскрибована з вищезгаданого гена, включає послідовність рибонуклеїнової кислоти, яка відповідає [SEQ ID NO:2]. У ще одному оптимальному варіанті втілення винаходу рослина ячменю включає ген, який кодує мутант LOX-1, причому вищезгаданий ген включає принаймні одну, наприклад, 1, наприклад, 2, наприклад, 3, наприклад, 4, наприклад, 5 мутацій у принаймні одному, наприклад, 1, наприклад, 2, наприклад, 3 місцях сплайсингу. В оптимальному варіанті вищезгадана(і) мутація(ї) призводять до того, що вищезгадане принаймні одне місце сплайсингу є нефункціональним. МРНК, транскрибована з такого гена, таким чином, є ненормальною через відхилення сплайсингу. Відповідно, в 89632 32 оптимальному варіанті мРНК, транскрибована з гена LOX-1 рослини ячменю з нульовим LOX-1 згідно з винаходом, не кодує ніякого білка або кодує білок, який включає лише N-кінець LOX-1. Вищезгаданий білок може включати інші послідовності, кодовані ненормальною мРНК, які походять не від гена, який кодує LOX-1. У цьому контексті Nкінець LOX-1 включає від амінокислоти 1 до амінокислоти N, причому N є цілим числом у межах від 2 до 800, у ще кращому варіанті - у межах від 2 до 750, у ще кращому варіанті - у межах від 2 до 700, у ще кращому варіанті - у межах від 2 до 650, у ще кращому варіанті - у межах від 2 до 600, у ще кращому варіанті - у межах від 2 до 550, у ще кращому варіанті - у межах від 2 до 500, у ще кращому варіанті - у межах від 2 до 450, у ще кращому варіанті - у межах від 2 до 400, у ще кращому варіанті у межах від 2 до 378. В одному варіанті втілення винаходу рослина ячменю включає ген, який кодує мутант LOX-1, причому вищезгаданий ген має мутацію у місці сплайсингу, яка веде до мРНК, що кодує білок, який складається з амінокислот з 1 по 378 із [SEQ ID NO:3], а також додаткової амінокислотної послідовності, як походить не від LOX-1. В оптимальному варіанті вищезгаданий мутант LOX-1 складається з послідовності, вказаної у [SEQ ID NO:8]. В одному з найкращих варіантів втілення винаходу ген, який кодує мутантний LOX-1 рослини ячменю з нульовим LOX-1, включає нонсенсмутацію, причому вищезгадана мутація відповідає заміщенню G А у позиції 3574 [SEQ ID NO:1]. У ще кращому варіанті рослина ячменю з нульовим LOX-1 є рослиною, позначеною як D112, яка має інвентарний номер РТА-5487Американського зібрання типових культур (АТСС). В іншому з найкращих варіантів втілення винаходу ген, який кодує LOX-1 рослини ячменю з нульовим LOX-1, включає місце донора сплайсингу нефункціонального інтрона 3. МРНК LOX-1 вищезгаданої рослини, таким чином, кодує білок, який містить амінокислоти 1-378 LOX-1 та додаткові амінокислоти з інтрона 3, які містяться у [SEQ ID NO:8]. У ще кращому варіанті рослина ячменю з нульовим LOX-1 є рослиною, позначеною як А618, яка має інвентарний номер РТА-5584 Американського зібрання типових культур (АТСС). Рослини ячменю згідно з винаходом також можуть бути потомством рослини ячменю з нульовим LOX. Отже, рослина ячменю може бути потомством рослини, позначеної як D112, яка має інвентарний номер АТСС РТА-5487, або рослини, позначеної як А618, яка має інвентарний номер АТСС РТА-5584. Рослина ячменю згідно з винаходом може бути одержана будь-яким прийнятним способом, відомим спеціалістам у даній галузі, в оптимальному варіанті - одним зі способів, вказаних нижче (див., наприклад, Розділ 2 "Одержання ячменю з нульовим LOX-1"). В одному оптимальному варіанті втілення винаходу рослина ячменю з нульовим LOX-1 згідно з даним винахід має фізіологію росту рослини та розвиток зерна, які можна порівняти з відповідними характеристиками для ячменю дикого типу. 33 Таким чином, в оптимальному варіанті рослина ячменю з нульовим LOX-1 є подібною до ячменю дикого типу стосовно висоти рослини, кількості пагонів на рослину, початку цвітіння та/або кількості зерен на колос. Аспектом винаходу також є забезпечення рослини ячменю з нульовим LOX-1, причому вищезгадана рослина характеризується: (і) підвищеною стійкістю до хвороб; або (ii) зниженим потенціалом щодо вироблення мікотоксинів; або (iiі) тим, що має відновні клітини для застосування у тканинній культурі; або (iv) будь-якою комбінацією властивостей від (і) до (iiі). В одному варіанті втілення винаходу рослина ячменю є рослиною ячменю з нульовим LOX-1, за умови, що вищезгадана рослина ячменю не має мутації G у місці донора сплайсингу інтрона 5. У цьому варіанті втілення винахід також стосується рослинних продуктів, таких як солод, сусло, зброджені та незброджені напої, пиво, харчові або кормові продукти, одержані з рослини ячменю з нульовим LOX-1 або її частини, за умови, що вищезгадана рослина ячменю не має мутації G у місці донора сплайсингу інтрона 5. Вищезгаданий G, наприклад, відповідає G у позиції 2968 SEQ ID:1. Чиє рослинний продукт одержаним з рослини ячменю з даною мутацією, визначають шляхом виділення ДНК з вищезгаданого рослинного продукту та визначення присутності або відсутності вищезгаданої мутації традиційними способами, відомими спеціалістам у даній галузі. ДНК може бути виділена, наприклад, із сусла, пива або іншого напою шляхом ліофілізації, ресуспендування у водному буфері, екстрагування хлороформом/ізоаміловим спиртом, з наступним спиртовим осадженням. Наприклад, мутація G у місці донора сплайсингу інтрона 5 може бути розпізнана способом, описаним у патенті WO 2004/085652, виданому Hirota et al. 2. Одержання ячменю з нульовим LOX-1 Рослина ячменю згідно з винаходом може бути одержана будь-яким прийнятним способом, відомим спеціалістам у даній галузі. В оптимальному варіанті рослину ячменю винаходу одержують способом, який включає етапи мутагенізації рослини ячменю або її частини, наприклад, ячмінних зерен, з наступним відсівом та відбором рослин ячменю на наявність рослин, які мають менше, ніж 5% активності LOX-1. Цікавим є те, що даний винахід в одному аспекті стосується нового й дуже ефективного способу відбору, який має значну перевагу над способом відбору, описаним, наприклад, у патенті WO 02/053721, виданому Douma et al. Новий спосіб відбору дозволяє у відтворюваному режимі розпізнавати рослини ячменю, які не мають або мають дуже низьку активність LOX-1. Цей спосіб відбору включає одержання зерен або їх частин, таких як ембріони, з мутагенізованого ячменю та визначення активності LOX-1 у вищезгаданих зернах або їх частинах. Відповідно, мета даного винаходу полягає у забезпеченні способів одержання рослини ячме 89632 34 ню, яка включає менше, ніж 5% активності LOX-1 рослини ячменю дикого типу, включаючи етапи: (і) Визначення активності LOX-1 у ячмінних зернах дикого типу або її частинах; і (ii) Мутагенізації рослин ячменю та/або клітин ячменю та/або тканини ячменю та/або ячмінних зерен та/або ембріонів ячменю для одержання, таким чином, ячменю покоління М0; і (iiі) селекції вищезгаданих мутагенізованих рослин, зерен та/або зародків ячменю протягом принаймні 2 поколінь, з отриманням, таким чином, Мх рослин ячменю, де x є цілим числом 2; і (iv) одержання зерен або їх частин з вищезгаданих Мх рослин ячменю; і (ν) Визначення активності LOX-1 у вищезгаданих зернах або їх частинах; і (vi) відбору рослин, у яких активність LOX-1 мутагенізованих зерен або їх частин є меншою, ніж 5% активності LOX-1 зерен дикого типу або їх частин; для одержання, таким чином, рослини ячменю, яка включає менше, ніж 5% активності LOX-1 рослини ячменю дикого типу. Етап (іі) у вищенаведеному списку може включати мутагенізацію живого матеріалу, вибраного з групи, яка складається з рослини ячменю, клітин ячменю, тканини ячменю, ячмінних зерен та ембріонів ячменю, в оптимальному варіанті - вибраного з групи, яка складається з рослин ячменю, ячмінних зерен та ембріонів ячменю, у ще кращому варіанті - ячмінних зерен. В оптимальному варіанті активність LOX-1 мутагенізованих зерен визначають, застосовуючи такий самий тип матеріалу, як той, що застосовується для визначення активності LOX-1 ячмінних зерен дикого типу, тобто, в оптимальному варіанті ячмінне зерно або його частини з етапу (і) належить до того самого типу ячмінного зерна або його частин, що й згадане на етапі (iv). Наприклад, якщо активність LOX-1 ячменю дикого типу визначають в ембріонах ячменю дикого типу, в оптимальному варіанті етап (iv) включає визначення активності LOX-1 в ембріонах мутагенізованих рослин ячменю. Мутагенез може здійснюватися будь-яким прийнятним способом. В одному варіанті втілення мутагенез здійснюють шляхом інкубування рослини ячменю або її частини, наприклад, ячмінних зерен або окремих клітин з ячменю з агентом мутагенізації. Вищезгаданий агент є відомим спеціалістам у даній галузі, φ ним може бути, крім інших, наприклад, азид натрію (NaN3), етилметансульфонат (EMS), азидогліцерин (AG, 3-азидо-1,2пропандіол), метилнітрозосечовина (MNU) та малеїновий гідразид (МН). В іншому варіанті втілення мутагенез здійснюють шляхом опромінення, наприклад, ультрафіолетовими променями, рослини ячменю або її частини, такої як зерно. В оптимальних варіантах втілення винаходу мутагенез здійснюють згідно з будь-яким зі способів, вказаних нижче у Розділі 4. "Хімічний мутагенез". Необмежувальний приклад прийнятного протоколу мутагенезу наведено у Прикладі 1. В оптимальному варіанті мутагенез здійснюють таким чином, що прогнозована частота потрі 35 бного мутанта становить принаймні 0,5, наприклад, у межах від 0,5 до 5, наприклад, у межах від 0,9 до 2,3 на 10 000 зерен, при відборі ячменю М3. В оптимальному варіанті втілення, мутагенез здійснюють на ячмінних зернах. Мутагенізовані зерна визначаються як покоління М0 (див. також Фіг.1А). Після мутагенезу відбирають рослини ячменю, або їх частини, які включають менше, ніж 5%, в оптимальному варіанті - менше, ніж 1% активності LOX-1. Відбір здійснюють будь-яким прийнятним способом, відомим спеціалістам у даній галузі. В оптимальному варіанті відбір включає отримання зразка з рослини ячменю, наприклад, з ячмінного зерна, визначення активності LOX-1 у вищезгаданому зразку та відбір рослин, у яких вищезгаданий зразок має менше, ніж 5%, в оптимальному варіанті - менше, ніж 1% активності LOX-1 рослини ячменю дикого типу. Зразок може бути взятий з будь-якої прийнятної частини вищезгаданої рослини. Однак в оптимальному варіанті зразок беруть із зерна, у ще кращому варіанті - зразок беруть із тканини ембріона зерна, у ще кращому варіанті - зразок складається з тканини ембріона зерна. Взагалі, зразок може бути гомогенізований із застосуванням будьякого прийнятного способу до визначення активності LOX-1. В оптимальному варіанті втілення зразок беруть із покоління Мх зерна, де x є цілим числом 2 в оптимальному варіанті - x є цілим числом у межах від 2 до 10, у ще кращому варіанті - у межах від 3 до 8. В одному з найкращих варіантів втілення активність LOX-1 визначають у зернах М3 або зразку, взятого з зерна. У цьому варіанті втілення перевагу віддають вирощуванню мутагенізованих ячмінних зерен (покоління М0) для одержання рослини ячменю, які схрещують для отримання зерен М1. Процедуру повторюють, доки не будуть одержані зерна М3 (див. також Фіг.1А). Визначення активності LOX-1 здійснюють, застосовуючи будь-який прийнятний аналіз, в оптимальному варіанті - одним зі способів, вказаних у цьому описі нижче. Зокрема, в оптимальному варіанті аналіз дозволяє контролювати діоксигенування лінолевої кислоти до 9-HPODE через LOX-1. Взагалі, аналізи включають такі етапи: (і) Забезпечення зразка, одержаного з ячмінного зерна або його частини; і (ii) Забезпечення лінолевої кислоти; і (iiі) Інкубування вищезгаданого зразка з вищезгаданою лінолевою кислотою; і (iv) Виявлення діоксигенування лінолевої кислоти до 9-HPODE. Виявлення може здійснюватися прямо або непрямо. Згідно з даним винаходом, може застосовуватися будь-який прийнятний спосіб виявлення. В одному варіанті втілення винаходу виявляють гідропероксиди лінолевої кислоти. Гідропероксиди лінолевої кислоти можуть бути виявлені, наприклад, шляхом поєднання розщеплення вищезгаданих гідропероксидів лінолевої кислоти з окиснювальною реакцією, що забезпечує сполуку, яка піддається виявленню. Наприклад, це може здійснюватись, як описано у Прикладі 1. В іншому варі 89632 36 анті втілення 9-HPODE виявляють прямим способом, наприклад, шляхом спектрофотометрії, такої як HPLC, описана у Прикладі 9. В одному варіанті втілення винаходу активність LOX-1 визначають просто шляхом визначення кількості 9-HPODE у зразку з ячмінного зерна. Це може здійснюватися будь-яким прийнятним способом, відомим спеціалістам у даній галузі, наприклад, як вказано у Прикладі 9. Значення має те, при якому рівні рН здійснюють визначення активності LOX-1. В оптимальному варіанті вищезгадане визначення здійснюють при рівні рН, який допускає високу активність LOX-1, але лише низьку активність LOX-2. Отже, визначення активності LOX в оптимальному варіанті здійснюють при рН у межах від 3 до 6,5, наприклад, у межах від 3 до 4, наприклад, у межах від 4 до 5, наприклад, у межах від 5 до 6, наприклад, у межах від 6 до 6,5. В оптимальному варіанті рН становить близько 3, наприклад, близько 3,5, наприклад, близько 4, наприклад, близько 4,5, наприклад, близько 5, наприклад, близько 5,5, наприклад, близько 6, наприклад, близько 6,5, наприклад, близько 7. Також в оптимальному варіанті вищезгаданий зразок одержують при прийнятному рівні рН, наприклад, при рН у межах від 3 до 6,5, наприклад, у межах від 3 до 4, наприклад, у межах від 4 до 5, наприклад, у межах від 5 до 6, наприклад, у межах від 6 до 6,5. В оптимальному варіанті рН становить близько 3, наприклад, близько 3,5, наприклад, близько 4, наприклад, близько 4,5, наприклад, близько 5, наприклад, близько 5,5, наприклад, близько 6, наприклад, близько 6,5, наприклад, близько 7. Оптимальні способи відбору рослин ячменю згідно з винаходом описано авторами нижче у Розділі 5. "Відбір мутантів ячменю". Оптимальний приклад способу визначення активності LOX-1 представлено у Прикладі 1. Процедура відбору може бути пристосована до процедур аналізів мікротитрувальних планшетів або інших відомих відтворюваних, високопродуктивних форматів аналізу, які дозволяють здійснювати швидкий відсів з багатьох зразків. В оптимальному варіанті принаймні 5 000, наприклад, принаймні 7 500, наприклад, принаймні 10 000, наприклад, принаймні 15 000 мутагенізованих рослини ячменю піддають аналізові на активність LOX-1. Після відбору корисних рослин ячменю, які мають меншу за 5% активність LOX-1, необов'язково можуть бути здійснені один або більше додаткових відборів. Наприклад, вибрані мутанти можуть поширюватися далі, і наступні покоління знову можуть бути піддані відборові на активність LOX-1. Після відбору корисних рослин ячменю їх піддають селекції, наприклад, традиційній селекції. Способи селекції описано авторами нижче (Розділ "Селекція рослин" та Розділ "Схрещування ячменю"). Однак рослина ячменю згідно з винаходом може бути одержана іншими способами, наприклад, способами, які в результаті ведуть до зниженої транскрипції та/або трансляції LOX-1. Отже, 37 рослина ячменю з нульовим LOX-1 може бути одержана шляхом перетворення рослини ячменю нуклеїновокислотною послідовністю, яка включає, як функціонально зв'язані компоненти, промотор, який експресується в рослинах ячменю, послідовність ДНК та транскрипційну кінцеву ділянку, причому експресія вищезгаданої послідовності ДНК знижує експресію гена, який кодує LOX-1, шляхом: (і) антисмислового пригнічення експресії; або (іі) косупресійного пригнічення експресії; або (iiі) РНК-інтерференції. В одному варіанті втілення рослину ячменю одержують способом, який включає перетворення рослини ячменю нуклеїновокислотною послідовністю, здатною знижувати транскрипцію або трансляцію гена, який кодує LOX-1, наприклад, нуклеїновокислотною послідовністю, яка включає антисмислові послідовності LOX-1. Вищезгадані антисмислові послідовності можуть бути, наприклад, антисмисловою послідовністю [SEQ ID NO:1] або її фрагментом. Антисмислова послідовність має бути функціонально зв'язана з послідовністю промотора з гена, який експресується в рослинах ячменю. Необмежувальний приклад такого способу наведено нижче у Прикладі 16 цього опису. Рослина ячменю може бути перетворена будьяким прийнятним способом, наприклад, опосередкованим Agrobacterium tumefaciens перенесенням або опосередкованим бомбардуванням частинками поглинанням ДНК. Обсяг даного винаходу також охоплює одержання рослини ячменю з нульовим LOX-1 способом, який включає етапи: (і) Мутагенізації рослин ячменю та/або ячмінних зерен та/або зародків ячменю; і (іі) Визначення присутності або відсутності мутації у гені, який кодує LOX-1, причому вищезгадана мутація веде до гена для LOX-1, який кодує поліпептидну форму LOX-1, який включає менше, ніж 700 суміжних амінокислот послідовності, викладеної у SEQ ID NO:3, в оптимальному варіанті вищезгаданий поліпептид є N-кінцевим фрагментом LOX-1, який включає щонайбільше 700 Nкінцевих амінокислот із [SEQ ID NO:3], (iiі) Відбору рослин, які мають вищезгадану мутацію, для одержання, таким чином, рослини ячменю, яка включає менше, ніж 5% активності LOX-1 рослини ячменю дикого типу. У ще кращому варіанті вищезгадана мутація може вести до гена для LOX-1, який кодує будьякий з N-кінцевих фрагментів LOX-1, як було описано авторами вище. Вищезгадана мутація може бути виявлена з застосуванням будь-якого прийнятного способу, наприклад, секвенування гена LOX-1 або аналізу однонуклеотидного поліморфізму (SNP). Один приклад здійснення SNP-аналізу описано авторами нижче у Прикладі 13 та Прикладі 14. Відразу по одержанню рослини ячменю з нульовим LOX-1 з конкретною мутацією у гені LOX-1 (на зразок будь-якої з вищезгаданих мутацій) традиційними способами селекції, які с загальновідомими серед спеціалістів у даній галузі, можуть бути створені додаткові рослини ячменю з такою самою мутацією. Наприклад, вищезгадана росли 89632 38 на ячменю з нульовим LOX-1 може бути піддана зворотному схрещуванню в середовищі іншої культури ячменю. Фіг.9 показує приклад схеми такого зворотного схрещування. 3. Композиція Даний винахід також стосується композицій, які включають вищеописані рослини ячменю або їх частини, або композиції, одержані з вищезгаданих рослин ячменю або їх частин. Оскільки вищезгадані рослини ячменю мають менше, ніж 5%, в оптимальному варіанті - менше, ніж 1% активності LOX-1, композиції, які включають вищезгадані рослини ячменю або їх частини, або є одержаними з них, в цілому мають дуже низький рівень T2N та потенціал T2N. Приклади корисних композицій, які включають ячмінь з нульовим LOX-1, або є одержаними з нього, описано авторами нижче. В оптимальному варіанті вищезгадані композиції мають: (і) менше, ніж 30%, в оптимальному варіанті менше, ніж 20%, у ще кращому варіанті - менше, ніж 10%, у ще кращому варіанті - менше, ніж 5%, наприклад, менше, ніж 2%, наприклад, менше, ніж 1% T2N; і/або (ii) менше, ніж 30%, в оптимальному варіанті менше, ніж 20%, у ще кращому варіанті - менше, ніж 10%, у ще кращому варіанті - менше, ніж 5%, наприклад, менше, ніж 2%, наприклад, менше, ніж 1% потенціалу T2N; порівняно з композицією, яка включає рослини ячменю дикого типу, або є одержаною з них . Даний винахід в одному аспекті стосується ячмінних зерен, які включають менше, ніж 1% активності LOX-1 порівняно з зернами дикого типу. В оптимальному варіанті зерна зовсім не мають активності LOX-1. Даний винахід також стосується композицій, які включають вищезгадані зерна, та композицій, одержаних з вищезгаданих зерен. В одному аспекті винахід стосується композицій солоду, одержаних із зерен з нульовим LOX-1 шляхом осолодження. Під терміном "осолодження" слід розуміти пророщування замочених ячмінних зерен, яке здійснюють за контрольованих навколишніх умов (наприклад, як пояснюється на Фіг.11, етапи 2 та 3). Осолодження являє собою процес контрольованого вимочування та пророщування з наступним висушуванням ячмінного зерна. Ця послідовність подія є важливою для синтезу багатьох ферментів, які викликають модифікацію зерна - процес, який в принципі деполімеризує стінки мертвих клітин ендосперму й мобілізує поживні речовини зерна. У процесі наступного висушування створюються смак та колір завдяки реакціям хімічного підсмажування. Хоча солод насамперед застосовують для виробництва напоїв, він також може застосовуватися в інших промислових процесах, наприклад, як джерело ферментів у хлібопекарській промисловості, або як агент, який надає смаку та кольору, у харчовій промисловості, наприклад, як солод або як солодове борошно, або непрямо як солодовий сироп і т.ін. В одному аспекті даний винахід стосується способів одержання вищезгаданої композиції со 39 лоду. Способи в оптимальному варіанті включаючи етапи: (і) Забезпечення ячмінних зерен з нульовим LOX-1; (іі) Вимочування вищезгаданих зерен; (iiі) Пророщування вимочених зерен у заданих умовах; (iv) Висушування вищезгаданих пророщених зерен; для одержання, таким чином, композиції солоду з низькою активністю або відсутністю активності LOX-1. Наприклад, солод може бути одержаний будь-яким зі способів, описаних у публікації Hoseney (1994). Однак у даному винаході також може бути застосований будь-який інший прийнятний спосіб одержання солоду, наприклад, способи одержання особливих солодів, включаючи, крім інших, способи підсмажування солоду. Один необмежувальний приклад описано у Прикладі 6. В іншому аспекті винахід стосується композицій сусла, одержаних з композицій солоду, одержаних із зерен з нульовим LOX-1. Вищезгаданий солод може бути одержаний лише з зерен з нульовим LOX-1 або з сумішей, які включають інші зерна. Винахід також стосується композицій сусла, одержаних із застосуванням ячменю з нульовим LOX-1 або їх частин, окремо або у суміші з іншими компонентами. Вищезгадане сусло може бути першим та/або другим та/або подальшим суслом. Взагалі, композиція сусла має високий вміст аміноазоту та ферментованих вуглеводів, здебільшого мальтози. На Фіг.11 етапи з 4 по 6 пояснюють загальний спосіб одержання сусла з солоду. Зазвичай сусло одержують шляхом інкубування солоду з водою, тобто шляхом затирання. Під час затирання композиція солоду/води може супроводжуватися додатковими багатими на вуглеводи композиціями, наприклад, ячмінними, кукурудзяними або рисовими додатками. Неосолоджені злакові домішки зазвичай не містять активних ферментів, а отже, за забезпечення ферментів, необхідних для перетворення цукру відповідають солод або екзогенні ферменти. Взагалі, першим етапом у процесі виробництва сусла є перемелювання солоду для того, щоб вода могла отримати доступ до частинок зерна у фазі затирання, що по суті є продовженням процесу осолодження з ферментною деполімеризацією субстратів. Під час затирання перемелений солод інкубують з рідкою фракцією, такою як вода. Температуру або підтримують незмінною (ізотермічне затирання), або поступово підвищують. У будьякому разі розчинні речовини, утворені при осолодженні та затиранні, відходять у вищезгадану рідку фракцію до їх відокремлення шляхом фільтрації на сусло та залишкові тверді частинки, які називають дробиною. Це сусло також може називатися першим суслом. Після фільтрації одержують друге сусло. Подальші сусла одержують шляхом повторення процедури. Необмежувальні приклади прийнятних процедур одержання сусла описано у публікації Hoseney (supra). Композиція сусла також може бути одержана шляхом інкубування рослин ячменю з нульовим LOX-1 або їх частин, таких як неосолоджені рос 89632 40 лини з нульовим LOX-1 або їх частини, з одним або кількома прийнятними ферментами, такими як композиції ферментів або композиції сумішей ферментів, наприклад, Ultraflo або Cereflo (Novozymes). Композиція сусла також може бути одержана з застосуванням суміші солоду та неосолоджених рослин ячменю або їх частин, необов'язково з додаванням одного або кількох прийнятних ферментів під час вищезгаданого одержання. Даний винахід також стосується харчових композицій, кормових композицій та композицій, які є ароматичною сировиною, які включають рослини ячменю з нульовим LOX-1 або їх частини. Харчовими композиціями, наприклад, можуть бути, крім інших, осолоджені та неосолоджені ячмінні зерна, ячмінне борошно, хліб, каша, злакові суміші, які включають ячмінь, дієтичні продукти, такі як напої, які включають ячмінь, ячмінні сиропи та ячмінні композиції у формі пластівців, борошна або брикетів. До кормових композицій належать, наприклад, композиції, які включають ячмінні зерна та/або борошно. Композиції, які є ароматичною сировиною, описано авторами нижче. Винахід також стосується сумішей композицій згідно з винаходом. Наприклад, винахід в одному аспекті стосується композиції, яку одержують шляхом змішування (і) композиції, яка включає рослину ячменю або її частину, яка має менше, ніж 5% активності LOX-1 рослини ячменю дикого типу, та (іі) композицію солоду, одержану з зерен з нульовим LOX-1. В оптимальному аспекті даний винахід стосується напоїв, ще краще - одержуваних із солоду напоїв, ще краще - алкогольних напоїв, таких як пиво, які мають стійкі органолептичні якості, причому вищезгаданий напій одержують, застосовуючи ячмінь з нульовим LOX-1 або його частини. Отже, в одному з оптимальних варіантів втілення винаходу напій виготовляють шляхом ферментації ячменю з нульовим LOX-1 або його частин або його екстрактів, наприклад, шляхом ферментації сусла, одержаного з застосуванням солоду, одержаного з ячменю з нульовим LOX-1, окремо або у комбінації з іншими інгредієнтами. Однак в інших варіантах втілення винаходу напій є незбродженим напоєм, наприклад, суслом. Обсяг даного винаходу також передбачає можливість виготовлення вищезгаданого напою з неосолоджених рослин ячменю або їх частин. Однак в оптимальному варіанті вищезгаданий напій виготовляють з композиції, солоду, одержаних з ячмінних зерен з нульовим LOX-1. У ще кращому варіанті вищезгаданим напоєм є пиво. Воно може належати до будь-якого типу пива, відомого спеціалістам у даній галузі. В одному варіанті втілення пиво є, наприклад, світлим пивом. Пиво в оптимальному варіанті варять, застосовуючи композицію солоду, яка включає пророщений ячмінь з нульовим LOX-1. Однак композиція солоду також може включати інші компоненти, наприклад, інші пророщені або непророщені злаки, такі як ячмінь дикого типу, ячмінь з нульовим LOX1, пшениця та/або жито, або непророщену сировину, включаючи цукри, або композиції, які походять 41 з осолодженої або неосолодженої сировини, наприклад, композицій сиропів. Термін "органолептичні якості" означає якості, які сприймаються нюхом та смаком, їх аналізують, наприклад, підготовлені дегустатори. В оптимальному варіанті вищезгадані підготовлені дегустатори навчаються спеціально для розпізнавання альдегідних сторонніх присмаків, таких як T2N. Взагалі, група дегустаторів налічує у межах від 3 до 30 членів, наприклад, у межах від 5 до 15 членів. Група дегустаторів може оцінювати присутність різних смаків, таких як сторонні присмаки, наприклад, "паперовий", окиснений, старий та хлібний присмаки. Спосіб визначення "органолептичних якостей" напою описано авторами нижче у Прикладі 6. В оптимальних варіантах втілення стійкі органолептичні якості принаймні частково є результатом низького вироблення T2N або потенціалу T2N. Відповідно, мета даного винаходу полягає у забезпеченні напоїв, які виготовляють із застосуванням рослини ячменю (таких як пиво), в оптимальному варіанті - напоїв, які включають менше, ніж 50%, в оптимальному варіанті - менше, ніж 40%, у ще кращому варіанті - менше, ніж 35%, наприклад, менше, ніж 30%, наприклад, менше, ніж 20%, наприклад, менше, ніж 10%, наприклад, в оптимальному варіанті - менше, ніж 5%, наприклад, менше, ніж 2%, наприклад, менше, ніж 1% T2N та/або потенціалу T2N порівняно з напоєм, виготовленим із ячменю дикого типу, після зберігання протягом принаймні 1 тижня, в оптимальному варіанті - принаймні 2 тижнів, у ще кращому варіанті - принаймні 3 тижнів, у ще кращому варіанті - протягом принаймні 4 тижнів, наприклад, у межах від 1 до 3 місяців, у межах від 3 до 6 місяців, наприклад, у межах від 6 до 12 місяців, наприклад, понад один рік. Зберігання відбувається при температурі у межах від 15°С до 40°С, в оптимальному варіанті у межах від 30°С до 37°С, у ще кращому варіанті при 37°С. Напої згідно з винаходом в оптимальному варіанті включають щонайбільше 0,07, в оптимальному варіанті - щонайбільше 0,06, у ще кращому варіанті - щонайбільше 0,05, у ще кращому варіанті - щонайбільше 0,04, наприклад, щонайбільше 0,03 ppb (млрд.-1) вільного T2N після зберігання протягом принаймні 1 тижня, в оптимальному варіанті - принаймні 2 тижнів, у ще кращому варіанті - принаймні 3 тижнів, у ще кращому варіанті - протягом принаймні 4 тижнів, наприклад, у межах від 1 до 3 місяців, наприклад, у межах від 3 до 6 місяців, наприклад, у межах від 6 до 12 місяців, наприклад, понад один рік після зберігання при температурі у межах від 15°С до 40°С, в оптимальному варіанті - у межах від 30°С до 37°С, у ще кращому варіанті - при 37°С. В оптимальному варіанті напій також включає у межах від 1 до 10 -1 ррm (млн. ) сульфіту, у ще кращому варіанті - у межах від 2 до 8 ррm, у ще кращому варіанті - у межах від 3 до 7 ррm, у ще кращому варіанті - у межах від 4 до 6 ррm сульфіту. В одному з оптимальних варіантів втілення напої згідно з винаходом включають щонайбільше 0,04, у ще кращому варіанті - щонайбільше 0,03, наприклад, щонайбільше 0,025 ppb вільного T2N після зберігання про 89632 42 тягом 2 тижнів при 37°С. У ще одному оптимальному варіанті втілення винаходу напої згідно з винаходом включають щонайбільше 0,07, в оптимальному варіанті - щонайбільше 0,06, у ще кращому варіанті - щонайбільше 0,05, у ще кращому варіанті - щонайбільше 0,04, наприклад, щонайбільше -1 0,03 ppb (млрд. ) вільного T2N після зберігання протягом 4 тижнів при 37 С у присутності від 4 до 6 ррm сульфіту. В оптимальному варіанті напої згідно з даним винаходом мають менший "паперовий" присмак порівняно з подібним напоєм, виготовленим з ячменю, відмінного від ячменю з нульовим LOX-1, після зберігання протягом принаймні 10 місяців при температурі від 15 до 25°С, наприклад, близько 20°С. В оптимальному варіанті вищезгаданий "паперовий" присмак є меншим, ніж 90%, у ще кращому варіанті - меншим, ніж 80%, наприклад, меншим, ніж 70%, за оцінками підготовлених дегустаторів. В одному варіанті втілення винахід стосується напоїв, таких як пиво, з низьким рівнем деяких тригідроксіоктадеценових кислот, зокрема, напоїв з низьким рівнем 9,12,13-ТНОЕ. Тригідроксіоктадеценові кислоти мають гіркий смак (Baur and Grosch, 1977 and Baur et al., 1977) і тому є небажаними. Таким чином, бажано, щоб рівень 9,12,13ТНОЕ був якомога нижчим, в оптимальному варіанті - нижчим, ніж 1,3 ррm, наприклад, нижчим, ніж 1 ррm. Однак загальна концентрація 9,12,13-ТНОЕ у виготовленому з солоду напої (такому як пиво) також залежить від кількості солоду, який використовують для виготовлення вищезгаданого конкретного напою. Таким чином, в цілому міцне пиво включає більше 9,12,13-ТНОЕ, ніж легше пиво, і у більш міцному пиві допускається більш високий загальний рівень 9,12,13-ТНОЕ. Відповідно, в оптимальному варіанті напій згідно з винаходом має нижчий рівень 9,12,13-ТНОЕ, ніж нормальне пиво подібного типу. Такий напій може бути одержаний при застосуванні ячменю з нульовим LOX-1 для виготовлення вищезгаданого напою. Таким чином, оптимальні напої згідно з винаходом мають низьке співвідношення 9,12,13-ТНОЕ порівняно з внутрішнім стандартом, який передбачає поправку на кількість солоду, який застосовують для виготовлення вищезгаданого напою. Вищезгаданий стандарт може бути, наприклад, іншою тригідроксіоктадеценовою кислотою. Таким чином, для якості напою, такого як пиво, важливим є підтримання співвідношення різних тригідроксіоктадеценових кислот (ТНА) у певних межах. Несподівано було виявлено, що, крім низького рівня T2N, продукту шляху LOX-1 (див. Фіг.1В), напої, виготовлені з ячменю з нульовим LOX-1 згідно з винаходом, також мають дуже низький рівень 9,12,13-ТНОЕ (див. Фіг.1С) і, відповідно, дуже низьке співвідношення 9,12,13-ТНА з 9,10,13ТНА. Отже, в одному аспекті даний винахід стосується напоїв, таких як пиво, які мають стійкі органолептичні якості, причому вищезгаданий напій виробляють із застосуванням рослини ячменю або її частини, в оптимальному варіанті - ячменю з нульовим LOX-1, і співвідношення 9,12,13-ТНА з 43 9,10,13-ТНА у вищезгаданому напої становить не більше 1,8, в оптимальному варіанті - щонайбільше 1,7, у ще кращому варіанті - щонайбільше 1,6, у ще кращому варіанті - щонайбільше 1,5, у ще кращому варіанті - щонайбільше 1,4. Таким чином, особливу перевагу віддають вищезгаданому співвідношенню у межах від 0 до 1,8, в оптимальному варіанті - у межах від 0 до 1,6, наприклад, у межах від 0 до 1,4. В одному варіанті втілення вищезгадане співвідношення становить приблизно 1,3. Кількість 9,12,13-ТНОЕ та 9,10,13-ТНОЕ у напої визначають стандартними способами, наприклад, шляхом газової хроматографії-мас-спектрометрії, наприклад, як описано у публікації Hamber, 1991. В оптимальному варіанті вищезгадані ТНА є оксиліпінами перетворення лінолевої кислоти. Цікавим є те, що, напої з такими співвідношеннями ТНА можуть бути виготовлені з застосуванням рослини ячменю згідно з винаходом. В оптимальному варіанті вищезгадані напої виготовляють, без застосування іншого ячменю, крім ячменю з нульовим LOX-1, таким чином, щоб не утворювалось іншого солоду, крім солоду, одержаного з ячменю з нульовим LOX-1. В одному з оптимальних варіантів втілення винаходу напій має: (і) співвідношення 9,12,13-ТНА з 9,10,13-ТНА, як описано вище; і (іі) рівень вільного T2N після зберігання, як описано вище. В одному варіанті втілення винахід стосується напою, такого як пиво, з поліпшеною стійкістю піни порівняно з подібним традиційним напоєм. Такі напої можуть виготовлятися, наприклад, з ячменю з нульовим LOX-1 або його частин, наприклад, солоду. Стійкість піни визначають, наприклад, як описано у публікації Brautechnische Analysenmetoden, 2002. Винахід також стосується способів виготовлення вищезгаданого напою. Способи в оптимальному варіанті включають етапи: (і) Забезпечення композиції солоду, яка включає пророщені зерна з нульовим LOX-1; (іі) Переробки вищезгаданої композиції солоду у напій; для одержання, таким чином, напою зі стійкими органолептичними якостями. В одному з оптимальних варіантів втілення напоєм є пиво. У цьому разі етап переробки в оптимальному варіанті включає одержання сусла з вищезгаданої композиції солоду, наприклад, будьяким зі способів, як було описано авторами вище, та зброджування вищезгаданого сусла. Взагалі, алкогольні напої, такі як пиво, можуть виготовлятися з осолоджених та/або неосолоджених ячмінних зерен. Солод, крім хмелю та дріжджів, надає пиву смаку та кольору. Крім того, солод виконує функцію джерела зброджуваного цукру та ферментів. Схематичне зображення загального процесу виробництва пива показано на Фіг.11, а детальні описи прикладів прийнятних способів осолодження та варіння можна знайти, наприклад, в останній публікації Hoseney (supra). Існує багато регулярно оновлюваних способів аналізу ячменю, солоду та пивних продуктів [розроблених, наприклад, American Association of 89632 44 Cereal Chemist (1995); American Society of Brewing Chemists (1992); European Brewery Convention (1998); Institute of Brewing (1997)]. Ті чи інші пивоварні заводи застосовують багато конкретних процедур, і найбільш значні розбіжності є пов'язаними зі смаками місцевих споживачів. Згідно з даним винаходом, може застосовуватися будь-який подібний спосіб виробництва пива. Один необмежувальний приклад описано у Прикладі 6. Композиція солоду для вищезгаданого напою, наприклад, пива, солодових напоїв або незбродженого сусла, може бути одержана будь-яким зі способів, як було описано авторами вище. Сусло може бути одержане з вищезгаданої композиції солоду, як було описано авторами вище. Перший етап виробництва пива з сусла в оптимальному варіанті включає варіння вищезгаданого сусла. Під час варіння додають інші інгредієнти, наприклад, хміль, які надають пиву типових гірких і ароматних характеристик. Варіння сусла також викликає агрегацію між поліфенолами та денатурованими білками, які здебільшого осідають під час наступної фази охолодження сусла. Після охолодження сусло переносять до бродильних чанів, які містять дріжджі. В оптимальному варіанті вищезгадані дріжджі є пивними дріжджами, Saccharomyces carlsbergensis. Сусло піддають збродженню протягом будь-якого прийнятного періоду часу, зазвичай у межах від 1 до 100 днів. Під час кількаденної ферментації цукор перетворюється спирт та СО2 одночасно з розвитком деяких смакових речовин. Після цього пиво піддають подальшій переробці. Зазвичай його охолоджують. Воно також може піддаватися фільтруванню та/або лагеруванню процесові, який надає приємного аромату та менш дріжджового смаку. І нарешті, пиво пастеризують або фільтрують перед розливанням у тару (наприклад, пляшки або банки). Незважаючи не прогрес, досягнутий у галузі виробництва пива, існує потреба у зниженні рівня T2N, його попередників та потенціалу T2N у пиві. Відповідно, продовжує існувати потреба в новій сировині, зокрема, ячмені та солоді, які дають менше сторонніх присмаків готовому пиву. Таким чином, метою даного винаходу є забезпечення такого ячменю та солоду. 4. Хімічний мутагенез В одному аспекті в основі даного винаходу, принаймні частково, лежить застосування хімічного мутагенезу ячмінних зерен - способу, який застосовують для випадкового включення мутацій. Мутагенез ячменю здійснюють, застосовуючи будь-яку хімічну речовину для мутагенізації, однак в оптимальному варіанті його здійснюють шляхом обробки зерен NaN3, пророщування зерен, які вижили, з наступним аналізом потомства рослин. Покоління рослин, яке виросло з мутагенізованих зерен, під назвою М0, містить гетерозиготні химери для будь-якої даної мутації. Потомство, зібране після самоопилення, називають поколінням М1, і воно має як гетерозиготи, так і гомозиготи для даної мутації (пор. Фіг.1А та Фіг.9). Обробка зерен NaN3 не є рівноцінною обробці окремої клітини, оскільки зерна після обробки міс 45 тять деякі немутантні клітини та різні клітини, які мають мутації ДНК. Оскільки мутації у клітинному потомстві, які не ведуть до зародкової лінії, втрачаються, мета полягає у спрямуванні мутагена у кілька клітин, які розвиваються у репродуктивні тканини, які беруть участь у розвитку покоління М1. Для оцінки загальної ефективності мутації підраховували альбіносні химери та альбіносні рослини у поколіннях М0 та M1, відповідно. Підрахунок кількості мутантів як показника, залежного від кількості рослин, які вижили, дає оцінку ефективності мутації, тоді як підрахунок кількості мутантів як показника, залежного від кількості оброблених зерен, є комбінованою мірою як ефективності мутації, так і вбивання зерен. Слід зазначити, що клітини мають механізми забезпечення якості фактично не кожному етапі експресії гена, можливо, для пом'якшення впливу руйнівних мутацій. Одним добре дослідженим прикладом в еукаріотах є нонсенс-опосередкований розклад мРНК, позначений як NMD, який перешкоджає синтезові потенційно небезпечних, передчасно зрізаних білків (Maquat and Carmichael, 2001). При NMD термінуючий кодон визначається як передчасний за його позицією відносно розташованих за ним дестабілізуючих елементів. У Saccharomyces cerevisiae ними є приблизно визначені послідовності мРНК, а у клітинах ссавців ними є білкові комплекси, які відкладаються у місцях з'єднання екзон-екзон під час сплайсингу перед мРНК. Яким чином координується розпад нонсенс-мРНК та білків, які вони виробляють, - це тема для майбутнього дослідження. Мутації, які створюють кодони передчасної термінації (нонсенс-кодони) (РТС), іноді збільшують рівень альтернативно зрощених транскриптів, які уникають порушуючих мутацій, таким чином, потенційно зберігаючи функцію білка (Mendell and Dietz, 2001). Оскільки вважається, що трансляція та сплайсинг РНК відбуваються у різних клітинних компартментах, парадоксальним є виявлення механізму підвищувальної регуляції специфічної до антисмислового кодону мРНК, який діє незалежно від розривання енхансера сплайсингу в клітинах ссавців (Wang et al., 2002). Однак такі механізми не спостерігалися ні в рослинах ячменю згідно з даним винаходом, ні в інших рослинах. NMD, PCT та інші є особливо цікавими у контексті селекції рослин, оскільки ці явища збільшують кількість зерен, які можуть бути відібрані з метою визначення нових потрібних властивостей. 5. Вибір мутантів ячменю Один аспект даного винаходу стосується забезпечення умов відбору на активність LOX-1, при якому знижується активність, зумовлена LOX-2. В основі цих способів лежить несподіване виявлення того факту, що характер тканин ячменю, які піддаються відборові, та умови реакції можуть підвищувати активність LOX, зумовлену ферментом LOX1, і знижувати активність, зумовлену ферментом LOX-2. Хоча у відборі мутантів з низьким рівнем LOX, детально описаному у заявці РСТ/ІВ01/00207, опублікованій як патент WO 02/053721А1, виданий Douma et al., застосовували 89632 46 білковий екстракт кінчиків листя ячменю, з визначенням ферментної активності при рН7,5, дана публікація детально стосується сприятливих параметрів відбору, які дозволяють у відтворюваному режимі розпізнавати мутанти ячменю з нульовим LOX. По-перше, при відборі на активність LOX-1 важливим є застосування конкретних тканин рослин ячменю. В оптимальному варіанті до вищезгаданих тканин належить ячмінне зерно, у ще кращому варіанті - ембріони ячмінних зерен. Зазвичай відбір здійснюють на екстракті вищезгаданої тканини, тобто екстракті ячмінних зерен або ембріонах ячменю. У ще кращому варіанті екстракти для визначення активності LOX-1 включають або - у найкращому варіанті - складаються з гомогенізованої тканини ембріонів сухих ячмінних зерен. Таким чином, лише гранична активність, зумовлена LOX-2, сприяє визначенню активності. По-друге, аналізи активності LOX-1 здійснюють при рН, який в оптимальному варіанті інактивує ферменти аленоксидсинтази, таким чином, забезпечуючи на виході добру кількість HPODE. 6. Селекція рослин В одному варіанті втілення винаходу мета полягає у забезпеченні корисних з агрономічної точки зору рослин ячменю, які мають властивість нульового LOX-1. Виведення сорту може розглядатись як тривалий процес, який розпочинається лише з впровадження нової властивості. З точки зору селекціонерів рослин, Результатом цього етапу майже завжди є одержання рослини, яка має менш бажаний загальний профіль агрономічних властивостей, ніж у існуючих комерційних сортів. Крім властивості нульового LOX-1, існують інші важливі чинники, на які зважають спеціалісти у галузі створення комерційних сортів осолоджуваного ячменю, наприклад, врожайність, розмір зерна та інші параметри, які стосуються характеристик осолодження. Оскільки багато - якщо не всі таких властивостей виявилися такими, що можуть генетично контролюватися, було б дуже бажано отримати сучасні, гомозиготні, високоврожайні осолоджувані культури, які є результатом схрещування з рослинами ячменю з нульовим LOX-1, описаними уданій публікації. Зерна таких рослин ячменю забезпечують нову, кращу сировину, яка не має або має лише незначну здатність до перетворення лінолевої кислоти на 9-HPODE. Селекціонери ячменю, таким чином, мають відібрати й вивести рослини ячменю, які мають такі властивості, що в результаті забезпечують культури з втраченою функцією LOX-1. В альтернативному варіанті селекціонери ячменю можуть використовувати рослини згідно з даним винаходом для подальшого мутагенезу для створення нових культур, які походять від ячменю з нульовим LOX-1. Рослини ячменю згідно з даним винаходом можуть бути виведені згідно з будь-якою прийнятною схемою. 7. Схрещування ячменю Інша мета даного винаходу полягає у забезпечені елітних з агрономічної точки зору рослин ячменю, які мають властивість нульового LOX-1. Відповідно, цей винахід також є спрямованим на 47 способи створення нової рослини ячменю з нульовим LOX-1 шляхом схрещування першої батьківської рослини ячменю з другою батьківською рослиною ячменю, причому перша або друга рослина є ячменем з нульовим LOX-1. Крім того, і перша, і друга батьківські рослини ячменю можуть походити від сорту ячменю з нульовим LOX-1. Таким чином, будь-які подібні способи застосування сорту ячменю з нульовим LOX-1 є частиною цього винаходу: самозапилення, зворотне схрещування, схрещування з популяціями і т.ін. Усі рослини, одержані з застосуванням сорту ячменю з нульовим LOX-1 як батьківської рослини, охоплюються обсягом цього винаходу, включаючи ті, які було виведено з сортів, які походять від сорту ячменю з нульовим LOX-1. Ячмінь з нульовим LOX-1 також може бути застосований для генетичного перетворення у випадках, коли екзогенна ДНК є включеною і експресується у рослині або рослинній тканині з нульовим LOX-1. Способи зворотного схрещування можуть бути застосовані згідно з даним винаходом для перенесення характеристики нульового LOX мутованої рослини ячменю до іншого сорту, наприклад, Scarlett або Jersey, обидва з яких є сучасними, високоврожайними осолоджуваними культурами ячменю. У стандартному протоколі зворотного схрещування первісний сорт (рекурентний батьківський сорт) схрещують з другим сортом (нерекурентним батьківським сортом), який має один потрібний ген, який має бути перенесений. Одержане в результаті потомство з нульовим LOX-1 від цього схрещування після цього знову схрещують з рекурентним батьківським сортом, повторюючи процес, доки не отримують рослину ячменю, в якій практично всі характеристики, зумовлені рекурентним батьківським сортом, відтворюються у перетвореній рослині, додатково до перенесеного генетичного набору для властивості нульового LOX-1 нерекурентного батьківського сорту. Останнє покоління зворотного схрещування після цього піддають самоопиленню для одержання чистого потомства, яке має властивість нульового LOX-1 (пор. Фіг.9). Наявність відповідного рекурентного батьківського сорту є важливою для успішної процедури зворотного схрещування, метою якої є перенесення властивості нульового LOX-1 у первісний сорт. Для цього генетичний набір рекурентного сорту модифікують набором для властивості низького рівня LOX-1 з нерекурентного батьківського сорту, при одночасному збереженні практично всіх інших властивостей первісного сорту. Хоча способи зворотного схрещування спрощуються, коли характеристика, яка переноситься, є домінантним алелем, існує можливість зворотного схрещування алеля рецесивної властивості нульового LOX-1 - але у цьому разі є необхідним біохімічний аналіз, щоб визначити чи було перенесено потрібну характеристику. Спосіб прискорення процесу селекції рослин включає первісне розмноження створених мутантів шляхом застосування тканинної культури та способів регенерації. Таким чином, інший аспект даного винаходу полягає у забезпеченні клітин, які 89632 48 після вирощування та диференціації забезпечують рослини ячменю, які мають властивість нульового LOX-1. Наприклад, селекція може включати традиційне схрещування, одержання фертильних рослин з пиляка або застосування культури мікроспор. 8. Ферменти LOX Важливою метою даного винаходу є забезпечення рослин ячменю, які не мають здатності синтезувати активний фермент LOX-1. Ферменти LOX є великими мономерними білками з єдиним фактором негемвмісного заліза. Перевірка у Банку даних білків на сайті http://www.rcsb.org/pdb виявила, що структура кількох ферментів LOX визначається шляхом рентгенівської кристалографії. Білки мають спільні складчастість та організацію домену, причому кожен має менший N-кінцевий восьмиланцюговий β-барельний домен та більший Скінцевий домен, який складається, головним чином, з довгих α-спіралей. Атом заліза розташовується у С-кінцевому домені, де він координується з гістидиновими залишками і, унікально, з карбоксильним кінцем поліпептиду, який є ізолейцином. Кілька каналів ведуть від поверхні білка до місця поблизу розташування атома заліза, і вони, очевидно, забезпечують доступ для субстратів, поліненасичених жирних кислот та молекулярного кисню до активного сайту. Оскільки ліпосомне зв'язування LOX ліпідного тіла огірка залежить від присутності N-кінцевого β-бареля (May et al., 2000), і LOX-1 сої зв'язується з двошаровими мембранами у процесі, який посилюється іонами кальцію (Tatulian and Steczko, 1998), можна припустити, що ферменти LOX зв'язуються з ліпідними двошаровими мембранами, і це, найвірогідніше, є функцією N-кінцевого домену. Способи визначення активності LOX, а також виділення, характеризації та кількісного аналізу безпосередніх та подальших продуктів каталізу LOX є легко доступними для спеціалістів у даній галузі. 9. Продукти шляху LOX У різних варіантах втілення даний винахід стосується рослин ячменю або їх продуктів з блокованою здатністю до утворення алкеналу T2N. Ферменти LOX каталізують діоксигенування поліненасичених жирних кислот системою цис-1, цис-4 пентадієну. У рослинах С18 поліненасичені Δ9,12 жирні кислоти лінолева кислота (18:2 ) та αΔ9,12,15 ліноленова кислота (18:3 ) є головними субстратами LOX. Ліпоксигеназний шлях метаболізму жирної кислоти запускають шляхом додавання молекулярного кисню у позиції С-9 або С-13 ацильного ланцюга, забезпечуючи відповідні гідропероксиди 9- та 13-лінолевої або ліноленової кислоти. У разі лінолевої кислоти як субстрату можуть утворюватися 9або 13гіперпероксіоктадекадієнові кислоти (HPODE), тоді як 9- або 13-гіперпероксіоктадекатриєнові кислоти (НРОТЕ) є продуктами, які одержують тоді, коли субстратом є α-ліноленова кислота. У гідропероксидліазній гілці шляху LOX 9- та 13-гідропероксиди можуть бути згодом розщеплені до коротколанцюгових оксокислот та альдегідів (пор. Фіг.1В). Показовим є те, що 9-HPODE може зазнавати подальшого метаболізму до 9,12,13-ТНОЕ (пор. 49 Фіг.1С), ТНОЕ, що має гіркий смак (Baur et al., 1977; Baur and Grosch, 1977). Відповідно, рослини з інактивованим LOX-1 утворюють ТНОЕ у співвідношеннях, відмінних від тих, які спостерігають у рослинах дикого типу. Визнано, що даний винахід охоплює вплив на вироблення подальших метаболітів каталізу LOX1, які виробляються не як безпосередній продукт каталізованої LOX-1 реакції, а в результаті подальшої реакції або серії реакцій з використанням продукту каталізу LOX-1. Ці реакції включають спонтанну, фактор-індуковану або каталізовану ферментом ізомеризацію. Таким чином, на вироблення цих подальших метаболітів може впливати регулювання експресії гідропероксидліази (HPL). Якщо самоокиснення лінолевої кислоти може створювати молекули-прекурсори, пов'язані з утворенням T2N, то існує можливість подальшого зниження рівня алкеналу. Зокрема, очікується, що знижувальне регулювання генів, які кодують Д9десатуразу (перетворює стеаринову кислоту та олеїнову кислоту) або 12-десатуразу (перетворює олеїнову кислоту на лінолеву кислоту) має змінювати відносні пропорції Сів жирних кислот (стеаринової, олеїнової та лінолевої кислоти) шляхом зниження рівня жирних кислот після відповідного ферменту та збільшення рівня проміжного жирнокислотного субстрату. Прикладами, в яких застосовували вибіркову селекцію з застосуванням природних варіантів індукованих мутацій, використовували для поліпшення олій в олійних культурах, є, крім інших, високостеаринова (HS) соя (Graef et al., 1985), високоолеїновий (НО) рапс (Auld et al., 1992), а також HS та НО соняшник, описаний у публікаціях Osorio et al. (1995) та Soldatov (1976), відповідно. Особливо цікавим є те, що винахід охоплює вироблення альдегідів, які не є продуктами дії LOX-1, але виробляються під дією ферментів шляху LOX або шляхом ізомеризації альдегідів, наприклад, ізомеризації (3Z)-ноненалу до (2Е)ноненалу, як показано на Фіг.1В. Також визнано, що винахід охоплює вироблення спиртів, які відповідають альдегідам, які виробляються ферментами шляху LOX, і/або відповідають альдегідам, які виробляються а результаті вищезгаданої ізомеризації. Вищезгадані спирти зазвичай виробляються під дією ферментів, які належать до надродини альдокеторедуктаз (Srivastava et al., 1999), наприклад, через ферментне перетворення (2Е)ноненалу на (2Е)-ноненол. 10. Потенціал T2N Ще одна мета даного винаходу полягає у зниженні кількості або усуненні молекул, пов'язаних з утворенням T2N, включаючи утворення прекурсорів T2N та альдегідних адуктів. Хоча деякі хімічні реакції, пов'язані зі старінням пива, залишаються нез'ясованими, процеси окиснення визнаються головними причинами розвитку несвіжого смаку у пивних продуктах (Narziss, 1986; Ohtsu et al., 1986). Загально відомим є той факт, що головну роль в утворенні несвіжого смаку відіграє T2N. Коли цей альдегід утворюється у процесі виробництва пива на стаді виробництва до ферментації, він може брати участь в утворенні адуктів через 89632 50 зв'язування, наприклад, з амінокислотами та білками (Noel and Collin, 1995) - але, можливо, також з нуклеїновими кислотами, глутатіоном і т.ін. - а отже, бути захищеним від відновлення або окиснення бродильними дріжджами (Lermusieau et al., 1999). Однак адукти T2N також можуть утворюватися сульфітом під час ферментації, роблячи альдегід неактивним щодо смаку (Nyborg et al., supra). Більшість адуктів T2N переносять у готове пиво, в якому вільний T2N вивільнюється (Liegeois et al., 2002), причому кислотність та температура є важливими чинниками цього процесу. Адукти T2N включають частину потенціалу T2N, міру для розпаду адуктів T2N для вивільнення T2N за визначених умов реакції, наприклад, інкубації при 100°С, рН4,0, протягом 2год. Спеціалістам у даній галузі відомо, як використовувати потенціал T2N як показник того, яким чином пиво вивільнює T2N під час зберігання, наприклад, як описано у публікації Drost et al. (supra). Ячмінні зерна згідно з даним винаходом мають обмеження каталізованого LOX-1 утворення 9HPODE, молекули, яказазвичай функціонує як прекурсор у гілці шляху LOX, що веде до утворення T2N. Пиво, вироблене з застосуванням ячмінних зерен з нульовим LOX, таким чином, не тільки має дуже низький рівень T2N, але й дуже низький рівень потенціалу T2N. Обсяг даного винаходу охоплює ячмінні зерна з нульовим LOX-1, які забезпечують пивні продукти, в яких повністю відсутній T2N, або які містять незначну кількість потенціалу T2N, включаючи адукти T2N. Таким чином, під час зберігання пива, виробленого з застосуванням ячменю з нульовим LOX-1, характерні для T2N сторонні присмаки практично не з'являються або з'являються у незначній кількості. 11. Стійкість до хвороб Даний винахід також стосується стійкого до хвороб ячменю. Вважається, що рослинні LOX беруть участь у виробленні активних механізмів стійкості до хвороб, які мають загальну назву гіперчутливої реакції (HR), форми програмованого відмирання клітин (Rusterucci et al., 1999). При HR після інфекції відбувається швидке відмирання рослинних клітин, які знаходяться навколо місця інфекції, і це призводить до утворення некротичного пошкодження. Таким чином, обмежується поширення патогену й створюється перешкода для подальшого ушкодження решти органа рослини. У деяких рослинних патогенних системах HR є пов'язаною з експресією LOX, які мають специфічність до утворення 9-HPODE, і 9-НРОТЕ (Rusterucci et al., supra; Jalloul et al., 2002), можливо, через інтенсивне вироблення гіперпероксижирних кислот, викликає некроз тканини. Ген, який кодує LOX-1, експресується, насамперед, у ячмінних зернах, тоді як численні додаткові ферменти LOX експресуються у листі рослин. Відповідно, гілки шляху LOX, які ведуть до утворення 9-HPODE, 13-HPODE, 9-НРОТЕ та 13HPODE, функціонують у листі ячменю, і різні набори оксиліпінів відображають окремі інфекції та пошкодження. Подібний молекулярний сценарій було описано для листя картоплі (Weber et al., 1999). 51 Природні леткі альдегіди інгібують розвиток деяких патогенів у рослинах, і природна резистентність деяких рослин до конкретного патогену може пояснюватись утворенням летких альдегідів (Croft et al., 1993; Blee and Joyard, 1996; Vancanneyt et al., 2001). Таким чином, порівняно з рослиною дикого типу, змінений оксиліпіновий профіль рослин ячменю з нульовим LOX-1 згідно з винаходом може запобігати, знижувати, послаблювати або усувати присутність патогену, продукту патогену або продукту взаємодії між рослиною та патогеном. Одним необмежувальним прикладом патогену є Aspergillus (див. у цьому описі нижче). Отже, в одному варіанті втілення винахід стосується рослини ячменю з нульовим LOX-1, яка виявляє підвищену стійкість до хвороб. 12. Мікотоксини Даний винахід також розкриває застосування рослин ячменю зі зниженою сприйнятливістю до колонізації Aspergillus. Утворення колоній Aspergillus створює проблеми в ячмінних зернах, часто викликаючи забруднення канцерогенними мікотоксинами афлатоксином та стеригматоцистином. Оскільки на продукування афлатоксину грибком впливає високий рівень 9-HPODE, 9-НРОТЕ, 13-HPODE та 13-НРОТЕ, у патенті США №5,942,661, виданому Keller, вказується на трансгенні культурні рослини, які продукують вищезгадані гіперпероксижирні кислоти у кількостях, достатніх для інгібування продукування грибкових мікотоксинів. Крім того, вищезгаданий патент США, а також дані, наведені у публікації Burow et al. (2000), вказують, що 13-HPODE інгібує продукування афлатоксину, тоді як 9-HPODE підвищує продукування афлатоксину. Оскільки зерна з нульовим LOX-1 не мають активного ферменту LOX-1, вищезгадані зерна мають дещо вищий рівень 13-HPODE, ніж рослини дикого типу, але й нижчий рівень 9-HPODE відносно тканини генетично не модифікованої батьківської рослини. Таким чином, порівняно з зернами дикого типу, зерна з нульовим LOX-1, здатні протистояти колонізації Aspergillus або демонструють знижений рівень мікотоксину після забруднення Aspergillus. Отже, даний винахід стосується рослин ячменю зі зниженим рівнем мікотоксинів порівняно з рослинами ячменю дикого типу. 13. Ароматизатори Одним з аспектів даного винаходу також є застосування ячменю з нульовим LOX-1 для виробництва ароматизаторів та green note сполук. До цього часу більшість досліджень, пов'язаних з різними гілками шляху LOX у ячмені, були зосереджені на аспектах утворення ясмонової кислоти з 13-НРОТЕ (Turner et al., 2002) та стійкості до хвороб, як було описано вище. Менша увага приділялася гіперпероксижирним кислотам ячменю з альтернативними, комерційними цілями. Однак показовим є те, що цілковита відсутність активного LOX-1 у ячмінних зернах з нульовим LOX-1 може збільшувати кількість 13-HPODE та 13-НРОТЕ у вищезгаданих зернах. На основі цієї нової властивості з'являється можливість нового застосування, 89632 52 пов'язаного з придатністю до промислового застосування культури ячменю, наприклад, у виробленні коротколанцюгових аліфатичних альдегідів та спиртів (наприклад, сполук green note гексаналу/гексеналу та гексанолу/гексенолу). Деякі аспекти, пов'язані з виробленням green notes розкриваються у патентах, до яких, крім інших, належать патенти США №№6,008,034, 6,150,145 та 6,274,358, які обговорюються в цьому описі. Хоча у патенті США №6,008,034, виданому Hausler et al., розкривається застосування специфічної гідропероксидліаза для вироблення сполук green note, у патенті США №6,150,145, виданому Hauser et al., та патенті США №6,274,358, виданому Holtz et al., описується застосування стандартного рослинного матеріалу для такого процесу. Застосування зерен з нульовим LOX-1 для вироблення сполук green note включає застосування нової сировини для вищезгаданого вироблення. Нова сировина, яка походить з ячмінних зерен з нульовим LOX-1 згідно з даним винаходом, не може вважатися стандартним рослинним матеріалом, оскільки вона походить із зерен, які було відібрано згідно з протоколом мутагенезу, детально описаним у Розділах 4-7 даної публікації. Придатність до промислового застосування ячмінних зерен з нульовим LOX-1 вважається такою, що виходить за межі обсягу формули винаходу патентів, наведених у попередньому абзаці, насамперед, через те, що нова сировина, одержана з зерен з нульовим LOX-1 згідно з даним винаходом, значною мірою поліпшує нормальні обмеження, зумовлені каталізованим LOX-1 утворенням 9-HPODE та 9-НРОТЕ - двох гіперпероксижирних кислот, які не можуть функціонувати як молекули-прекурсори для ферментного утворення green notes цис-3гексеналу та цис-3-гексенолу. 14. Гетерологічна експресія генів, які кодують LOX У різних варіантах втілення даний винахід стосується трансгенних рослин ячменю, які мають властивість нульового LOX-1. Очевидно, майбутній прогрес у генній інженерії рослин дозволить створити рослини ячменю з пригніченим синтезом LOX-1. Було запропоновано концепцію як засіб контролю утворення стороннього присмаку, але результати такого підходу не повідомляються (McElroy and Jacobsen, 1995). Описаний авторами винахід може бути застосований у зв'язку з такими майбутніми поліпшеннями для створення рослин з анти смисловим LOX-1, які мають анти смислові конструкції, комплементарні принаймні частині інформаційної РНК (мРНК) для послідовностей LOX-1. Антисмислові нуклеотиди будують для гібридизації з відповідною мРНК, наприклад, подібною до описаної для експресії антисмислової послідовності SnRKl протеїнкінази у трансгенному ячмені (Zhang et al., 2001). Модифікації антисмислових послідовностей можливі доти, доки послідовності гібридизуються й перешкоджають експресії відповідної мРНК. Таким чином, можуть бути застосовані антисмислові конструкції, які мають 70%, в оптимальному варіанті - 80%, у ще кращому варіанті - 85% ідентичності послідовності з відповідними антисмисловими послідовності. Крім того, 53 можуть застосовуватися частини антисмислових нуклеотидів для переривання експресії заданого гена. Зазвичай застосовують послідовності з принаймні 50 нуклеотидів, 100 нуклеотидів, 200 нуклеотидів або більшої кількості. Таким чином, сфера застосування цього винаходу не обмежується лише рослинами, одержаними традиційними способами мутагенезу. Хоча заміна заданого гена через гомологічну рекомбінацію є надзвичайно легкою у дріжджах, її ефективність у більшості багатоклітинних еукаріотах залишається обмеженою і не дозволяє створювати такі рослини ячменю, а також набір генома - широкого розриву генів (Parinov and Sundaresan, 2000). Пригнічення експресії гена останнім часом застосовували для дослідження ролі ~86% прогнозованих генів генома Caenorhabditis elegans у кількох процесах розвитку (Ashrafi et al., 2003; Kamath et al., 2003). Для створення рослин ячменю з повною втратою функції конкретного гена, такого як ген, що кодує LOX-1, застосування способу РНКінтерференції (RNAi) має кілька недоліків. До них належать відсутність стійкої спадковості фенотипу, мінливий рівень залишкової активності гена (Hannon, 2002; Bargman, 2001; Wesley et al., 2001) та нездатність одночасно пригнічувати експресію кількох не пов'язаних генів (Kamath et al., 2000). Нуклеотидні послідовності згідно з даним винаходом також можуть застосовуватись у смисловій орієнтації для пригнічення експресії ендогенних генів, які кодують ферменти LOX у рослинах. Способи пригнічення експресії гена у рослинах із застосуванням нуклеотидних послідовностей у смисловій орієнтації відомі спеціалістам у даній галузі (див., наприклад, патент США №5,283,184, виданий Jorgensen and Napoli). Ці способи зазвичай включають перетворення рослин з послідовністю ДНК, яка включає промотор, який приводить у дію експресію в рослині, функціонально зв'язаний принаймні з частиною нуклеотидної послідовності, яка відповідає транскриптові ендогенного гена. Зазвичай така нуклеотидна послідовність має суттєву ідентичність з послідовністю транскрипту ендогенного гена, в оптимальному варіанті - більше, ніж приблизно 65% ідентичності послідовності, у ще кращому варіанті - більше, ніж приблизно 85% ідентичності послідовності, у найкращому варіанті - більше, ніж приблизно 95% ідентичності послідовності. Різні аспекти, які стосуються гетерологічної експресії генів, які кодують ферменти LOX, є описаними й розкритими у патентній заявці США, № публ. 2003/0074693 Α1, від імені Cahoon et al. Хоча у вищезгаданій патентній заявці наводяться способи існуючого рівня техніки по відношенню до ферментів LOX ячменю і розкривається багато кодуючих LOX послідовностей генів, жоден з генів ячменю, які кодують LOX-1, LOX-2 та LOX-3, не виявляє достатнього ступеня ідентичності, яка охоплюється обсягом формули винаходу патентної заявки США, № публ. 2003/0074693 Α1, від імені Cahoon et al. Хоча винахід було детально описано у представленому вище описі, останній вважається таким, що має ілюстративний, але не обмежуваль 89632 54 ний характер, і слід розуміти, що всі зміни та модифікації, які відповідають сутності винаходу, потребують захисту. Відповідно, стає зрозумілим, що деякі зміни та модифікації, такі як модифікації та мутації окремих генів, сомаклональні варіанти, окремі варіанти, вибрані з-поміж великих популяцій рослин даної культури, і т.ін., можуть охоплюватись обсягом винаходу, який обмежується лише обсягом формули винаходу, яка додається. Винахід далі описується з посиланням на представлені нижче конкретні приклади; вони пропонуються для додаткового пояснення даного винаходу, але не розглядаються як такі що обмежують його обсяг. 15 Інгібітори LOX Даний винахід також стосується способів зниження або запобігання активності ячменю LOX-1. Кілька інгібіторів LOX можуть бути вибрані з-поміж класів окиснювально-відновних та неокиснювально-відновних інгібіторів, антиоксидантів, агентів утворення комплексів заліза, імідазолвмісних сполук, похідних бензопірану і т.ін. Таким чином, винахід в одному варіанті втілення стосується способу зниження активності LOX ячменю (в оптимальному варіанті - LOX-1), який включає етапи: (і) забезпечення рослини ячменю або її частини або рослинного продукту, одержаного з ячменю, (іі) забезпечення інгібітора LOX (ііі) інкубації вищезгаданої рослини ячменю або її частини або рослинного продукту, одержаного з ячменю з вищезгаданим інгібітором LOX, таким чином, знижуючи активність LOX ячменю (в оптимальному варіанті - LOX-1). В одному варіанті втілення вищезгаданим рослинним продуктом є солод, і вищезгаданий інгібітор LOX додають до вищезгаданого солоду у процесі затирання. В результаті в оптимальному варіанті забезпечується зниження рівня T2N у суслі, одержаному у вищезгаданому процесі затирання. Вищезгаданою рослиною ячменю або її частиною або рослинним продуктом, одержаним з ячменю, може бути ячмінь з нульовим LOX-1 або його частини або рослинний продукт, одержаний з ячменю з нульовим LOX-1. Однак згідно з цими способами можуть застосовуватися й інші різновиди ячменю. Серед різних інгібіторів LOX окиснювальновідновні інгібітори LOX можуть бути вибрані зпоміж похідних катехолбутану, таких як будь-які з описаних у патентах США №№5,008,294, виданому Jordan et al., 4,708,964, виданому Allen, та 4,880,637, виданому Jordan, наприклад, нордигідрогваяретова кислота (NDGA) або один з її енантіомерів. Інгібітор окиснення LOX краще вибирати зпоміж фенолів, флавоноїдів і т.ін. Інгібітор окиснення LOX також може бути вибраний з-поміж галатів, включаючи октилгалат. Для підтвердження того, що сполука дійсно є інгібітором LOX, здійснюють аналіз, як описано авторами нижче у Прикладі 18. У промисловості октилгалат є відомим інгібітором ліпоксигенази сої (На et al., 2004) і являє осо 55 бливий інтерес, оскільки у даний час він є дозволеним для застосування як антиоксидантна добавка для харчових продуктів (Aruoma et al., 1993). Ця властивість викликала інтерес до випробування очищеного ячменю LOX-1 на активність у присутності можливого інгібітора октилгалату. Цікавим є те, що присутність октилгалату під час затирання в результаті забезпечує зниження рівня T2N. Втілення даного винаходу, таким чином полягає у забезпеченні інгібітора LOX-1, a також його застосування, яке після додавання до сусла забезпечує зниження рівня T2N. Приклади Наведені авторами приклади пояснюють оптимальні варіанти втілення винаходу і не повинні тлумачитись як такі, що обмежують винахід. Якщо не вказано іншого, для маніпуляцій з нуклеїновими кислотами та бактеріями, здійснювали основні технології молекулярної біології, як описано у публікаціях Sambrook et al. (1989) та Sambrook and Russell (2001). Для зрозумілості опису, але не для його обмеження, даний розділ прикладів розділено на такі теми: (і) Відбір та вибір мутантів (іі) Мутанти ячменю D112 та А618 (iiі) Фізіологічні властивості мутантів ячменю D112 та А618 (iv) Мутанти D112 та А618 є рослинами з нульовим LOX-1 (ν) Затирання (vi) Вироблення солоду та пива з застосуванням солоду дикого типу та мутантного ячменю (vii) Тригідроксіоктадеценові кислоти у пиві з солоду з нульовим LOX-1 (viii) Тригідроксіоктадеценові кислоти у пиві (iх) Біохімічна характеризація ферментних продуктів дії LOX у ячмені (х) Ген, який кодує LOX-1 у мутанті ячменю D112, є мутованим (хі) Ген, який кодує LOX-1 у мутанті ячменю А618, є мутованим (хіі) Виявлення шляхом RT-PCR транскриптів для LOX-1 (хііі) Генетичне виявлення мутантів ячменю, які мають мутацію D112 (xiv) Виявлення мутантів у сумішах зразків (xv) Рекомбінантний LOX-1 мутанта D112 є неактивним (xvi) Трансгенні рослини ячменю (xvii) Green note-сполуки (xviii) Інгібітори LOX-1 (хіх) Затирання з октилгалатом Приклад 1 Відбір та вибір мутантів Мутагенез ячменю. Зерна, зібрані з рослин ячменю сортів Barke, Celeste, Lux, Prestige, Saloon та Neruda, інкубували окремо з мутагеном NaN3 згідно з деталями, викладеними у публікації Kleinhofs et al. (1978). Цю процедуру було вибрано, оскільки відомо, що вона викликає точкові мутації у геномній ДНК ячменю і забезпечує заміщення або зрізання амінокислот у білках, які кодуються мутагенізованою ДНК. 89632 56 В описаних у даній публікації експериментах з мутагенезом розмножували мутовані зерна покоління М1 на ділянках поля протягом двох послідовних поколінь, зрештою одержуючи велику частку гомозиготних рослин для відбору (Фіг.1А). Очікувалося, що мутантні зерна одержаного в результаті покоління М3 мають траплятися з частотою 0,9-2,3 на 10 000 зерен (Kleinhofs et al., supra). Показовим є те, що зерна М2 не відбирали, насамперед, через те, що вони містять відносно високу частку гетерозиготних точкових мутацій. Відбір. Мета полягала в розробці швидкої високопродуктивної процедури відбору для виявлення зерен мутантного ячменю М3, які не мають активності LOX-1, для уникнення важкої процедури відбору з застосуванням кінчиків листя, які, за відомостями, містять кілька видів активності LOX (як описано у заявці РСТ/ІВ01/00207, опублікованій як патент WO 02/053721А1, виданий Douma et ah). Увагу було приділено визначенню активності LOX в ембріоні, включаючи тканину щитку зародка, зрілих ячмінних зерен. Взагалі, умови аналізу були подібними до описаних у публікації Anthon and Barrett (2001). Аналіз ґрунтувався на каталізованому LOX одержанні гідропероксидів лінолевої кислоти, які - у каталізованій гемоглобіном реакції в окиснювальному режимі з'єднують 3-метил-2бензотіазолінон з 3-(диметиламіно)бензойною кислотою, в результаті чого утворювався синій колір, який може бути виміряний спектрофотометрично. На практиці одну серію аналізів розпочинали з окремої гомогенізації тканини 96 ембріонів ячменю, включаючи щиток зародка, у композиції дрібного порошку. їх переносили до планшетів для зберігання крижаної температури (ABgene), в яких кожна з 96 лунок по 1,2мл містила круглу 5міліметрову скляну кульку та 200мкл Н2О. Після цього планшет інкубували протягом 35сек у лабораторному млині MM 300 (Retsch), з електронним регулюванням вібрації з частотою 27сек-1. Після цього планшет центрифугували при 4 000об./хв у центрифузі Allegra 6R Centrifuge (Beckman-Coulter) протягом 15хв. при 4°С для осадження нерозчинного матеріалу, а після цього тримали на льоді не більше 120хв. до подальшої обробки. 96-лунковий планшет переносили до автоматизованої робочої станції Biomek 2000 (BeckmanCoulter), яку було запрограмовано для відмірювання піпеткою згідно з аналізом на LOX, як описано у публікації Anthon and Barrett (supra). Згодом екстракти ембріонів (96 26мкл) переносили до стандартного 96-лункового мікротитрувального планшета (Nunc) з наступним додаванням 90мкл Реагента А [12,5мМ 3-(диметиламіно)бензойної кислоти, 0,625мМ лінолевої кислоти (одержаної, як детально описано у Прикладі 9)] та 90мкл Реагента В (0,25мМ 3-метил-2-бензотіазолінгідразону, 0,125мг/мл гемоглобін); Реагент А одержували спочатку шляхом змішування 155мкл лінолевої кислоти, що відповідало 134 мг вільної кислоти (Sigma, L-1376) та 257мкл Tween-20, потім додавали Н2О до об'єму 5мл з наступним додаванням 600мкл 1М NaOH, і коли розчин ставав прозорим, його доводили до 20мл додатковою Н2О. А595 вимірювали у кожній з 96 лунок планшета, засто 57 совуючи спектрофотометр Flourostar Galaxy (BMG Labtechnologies), з забарвленням гідропероксидних продуктів, яке є мірою загальної активності присутнього LOX [активність, відповідно, вказується в одиницях А595 (A595 U)]. Розпізнавання потенційних мутантів. Зерна ячменю сорту Barke (одержані від загальної кількості 2 160 ліній), сорту Celeste (2 867 ліній), сорту Lux (2 625 ліній), сорту Prestige (1 379 ліній), сорту Saloon (1 743 лінії) та сорту Neruda (3 780 ліній) відбирали на активність LOX з метою розпізнання зерен зі значним зниженням вищезгаданої активності порівняно з зернами дикого типу. Загалом попередньо розпізнавали 90 потенційних мутантів у поколінні М3 [сорт Barke (12 ліній), сорт Celeste (38 ліній), сорт Lux (9 ліній), сорт Prestige (16 ліній), сорт Saloon (12 ліній) і сорт Neruda (3 ліній)]. Зерна кожного з цих мутантів розмножували до покоління М4, збирали, а потім заново відбирали на властивість, пов'язану з дуже низькою активністю LOX. Зрештою, лише одна лінія сорту Barke, позначена як мутант D112, та одна лінія сорту Neruda, позначена як мутант А618, виявилися такими, що демонструють вищезгадану дуже низьку загальну активність LOX. Детальні вимірювання активності LOX здійснювали з екстрактами зрілих, перебуваючих у стані спокою зерен, у яких активність LOX зумовлювалася майже виключно LOX-1 (Schmitt and van Mechelen, 1997). Для ембріонів сухих, зрілих зерен покоління М3 мутанта D112 загальна активність LOX, яку вимірювали шляхом колориметричного аналізу LOX, як описано вище (пор. Фіг.2; Таблиця 1), становила 0,407±5,8% А595 U/ембріон, тоді як відповідний показник для сорту Barke становив 1,245±7,6% А595 U/ембріон. У другій серії експериментів виявляли активність LOX в екстрактах зародків зрілих, сухих зерен покоління М3 мутанта А618 нарівні 0,221±2,6% А595 U/ембріон, тоді як в екстрактах дикого типу сорту Neruda було виявлено 0,721±3,6% А595 U/ембріон (Фіг.3; Таблиця 1). Приклад 2 Мутанти ячменю D112 та А618 Аналізи здійснювали для того, щоб з'ясувати, чи є рослини з нульовим LOX-1 поколінь М4 та М5 гомозиготними для відповідного мутантного фенотипу. Цей тип аналізу застосовували для визначення рецесивного або домінантного характеру даної мутації у поколінні М3. Іншими словами, якщо рослини покоління М3 є гетерозиготними для домінантної мутації, то наступні покоління будуть сегрегувати щодо цього фенотипу. Загальну активність LOX вимірювали в ембріонах поколінь М3, М4 та М5 мутантів ячменю D112 та А618, і активність була співставною з показниками ембріонів сорту Barke та сорту Neruda, відповідно. Визначення активності LOX відбувалося, як описано у Прикладі 1 даної публікації. В усіх експериментах стандартні екстракти з ембріонів сорту Barke, а також інактивовані нагріванням стандартні екстракти з ембріонів сорту Barke застосовували як контрольні зразки. Для ембріонів зерен покоління М4 мутанта D112 середня загальна активність LOX становила 0,334±1,5% А595 U (n=12), а для ембріонів зерен 89632 58 покоління М5 мутанта D112 вона становила 0,294±4,1% А595 U (n=90). Для порівняння: ембріони сорту Barke дикого типу покоління М4 та покоління М5 давали 0,738±3,2% А595 U (n=2) і 0,963±7,5% А595 U (n=90), відповідно (пор. Фіг.4; Фіг.5; Таблиця 1, Експеримент 1). Ембріони покоління М4 мутанта ячменю А618 давали середню активність LOX 0,222±2,1% А595 U (n=4). Інші результати цього експерименту виявили, що активність LOX в ембріонах сорту Neruda становила 0,684±5,8% А595 U (n=90). Результати показано на Фіг.6 і в Таблиці 1, Експеримент 2. Отже, експериментальні дані підтвердили, що зерна поколінь М4 та М5 мутанта D112 були гомозиготними щодо генетичної властивості, характерної для дуже низької загальної активності LOX. Таку саму властивість було продемонстровано для зерен покоління М4 мутанта А618. Приклад 3 Фізіологічні властивості мутантів ячменю D112 та А618 Розведення рослин у теплиці. Зерна сорту Barke та мутанта D112 (покоління М4 та М5) пророщували й вирощували у теплиці з освітленням 20год. при 12°С і відносній вологості 65%. Характеристики росту мутанта D112 та рослин дикого типу сорту Barke були схожими стосовно висоти рослин, кількості пагонів на рослину, початку цвітіння та кількості зерен на колос. Таким чином, можна зробити висновок, що мутант D112 не тільки має фізіологію росту, як у рослини дикого типу, але й нормальний розвиток зерна. Зерна мутанта А618 покоління М4 та зерна сорту Neruda пророщували й вирощували у теплиці в умовах світла/темряви 20год./4год. при 12°С та відносній вологості 65%. При порівнянні мутанта А618 та сорту Neruda не спостерігали різниці щодо висоти рослини, кількості пагонів на рослину, початку цвітіння та кількості зерен на колос. Однак верхня сторона зерен мутанта А618 відрізнялася від материнського сорту Neruda ненормальною дірчастою структурою.Тобто, можна зробити висновок, що мутант А618 демонструє фізіологію росту, схожу на ту, яку має рослина дикого типу, але ненормальний розвиток зерна. Агрономічні характеристики мутанта D112 у польових умовах. Мутант D112 та рослини сорту Barke порівнювали у польових випробуваннях для виявлення можливих розбіжностей щодо висоти рослини, дати колосіння, стійкості до хвороб, полягання, ламання колосся, часу визрівання та врожайності (див. Таблицю 2). Випробування здійснювали згідно зі стандартними процедурами для польових випробувань. Відповідно, однакову кількість зерен мутанта D112 2 та сорту Barke висівали на ділянки 7,88м у 2 місцях, у кожному про 3 зернини. Агрономічні характеристики, в яких особливе значення мають описані вище властивості, уважно спостерігали протягом усього сезону росту. Не спостерігалося розбіжностей щодо агрономічних властивостей ні для мутанта D112, ні для сорту Barke. Приклад 4 Мутанти D112 та А618 ε рослинами з нульовим LOX-1 59 Аналізи білка. Здійснювали представлені нижче аналізи для характеризації фенотипу мутантів D112 та А618. Здійснювали вестерн-блот-аналізи екстрактів ембріонів, видалених із перебуваючих у стані спокою ячмінних зерен. Один ембріон екстрагували у 300мкл води крижаної температури у ступці, екстракти переносили до мікроцентрифугувальної трубки і центрифугували при 10 000xg. Аліквоти зразків, які включали 10мкл необроблених екстрактів, відокремлювали шляхом електрофорезу у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію (SDS-PAGE) згідно з описами, представленими у публікації Laemmli (1970). Відокремлені білки після цього переносили на нітроцелюлозні мембрани шляхом напівсухого блотингу, як детально описано у публікації Towbin et al. (1979). Пляму випробували розведенням 1:500 LOX-1-специфічного моноклонального антитіла 5D2 (Holtman et al., 1996) з наступною інкубацією з антитілом кози проти миші, з'єднаним з лужною фосфатазою, і виявляли субстратами лужної фосфатази тетразолієм нітросинім та 5-бромо-4хлоро-3-індоліл-фосфатом, як описано у публікації Holtman et al. (supra). LOX-1 виявляли антитілами 5D2 в екстрактах ембріонів сорту Barke, і білок мігрував у SDS-PAGE подібним чином до LOX-1 сорту Vintage. LOX-1, який піддається виявленню шляхом імуноаналізу, був відсутній у зразках мутанта D112, але білок можна було виявити в екстрактах сорту Barke, мутантна лінія G, та сорту Vintage. Вестерн-блотинг ліній потомства сорту Barke та мутанта D112 покоління М4 виявив, що білок LOX1 був присутнім у зернах ембріонів сорту Barke, але не у будь-яких зернах потомства мутанта D112 (Фіг.7), таким чином, підтверджуючи, що властивість нульового LOX-1 є генетично стійкою. Дані були статистично значущими, як визначали за критерієм хі-квадрата (р