Гуманізоване антитіло з протипухлинною активністю
Номер патенту: 108349
Опубліковано: 27.04.2015
Автори: Кінцле Норберт Александер, Поллард Меттью, Дженнінгз Філіп Ентоні, Кларк Адам Уілльям, Дойл Ентоні Джерард
Формула / Реферат
1. Антитіло, яке зв'язується з клітинами Colo205, де антитіло містить зв'язувальний домен VH і зв'язувальний домен VL, де
(a) зв'язувальний домен VH містить послідовно першу каркасну область (FR1), першу CDR (CDR1), другу каркасну область (FR2), другу CDR (CDR2), третю каркасну область (FR3), третю CDR (CDR3) і четверту каркасну область (FR4), де:
(i) послідовність FR1 являє собою X1VQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVX2GYSX3X4 (SEQ ID NO: 95), де:
X1 означає Q або Е,
X2 означає S або Т,
X3 означає I,
X4 означає S або Т;
(ii) послідовність CDR1 являє собою SGYSWH (SEQ ID NO: 96);
(iii) послідовність FR2 являє собою WIRQX5PGKGLX6WX7G (SEQ ID NO: 97), де
X5 означає S або Р,
X6 означає Q або Е,
X7 означає M або I;
(iv) послідовність CDR2 являє собою HIHX8SGRPTYX9PSLX10S (SEQ ID NO: 98), де
X8 означає F,
X9 означає N,
X10 означає K, L, Н, F, R або S;
(v) послідовність FR3 являє собою RX11X12ISX13X14TAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: 99), де
X11 означає V або I,
X12 означає Т або S,
X13 означає R або K,
X14 означає Е або D;
(vi) послідовність CDR3 являє собою KGKGSDDGLNY (SEQ ID NO: 100);
(vii) послідовність FR4 являє собою WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 101); і
(b) зв'язувальний домен VL містить послідовно першу каркасну область (FR1), першу CDR (CDR1), другу каркасну область (FR2), другу CDR (CDR2), третю каркасну область (FR3), третю CDR (CDR3) і четверту каркасну область (FR4), де:
(i) послідовність FR1 являє собою EX13VLTQSPGTLSLSX14GERATLSC (SEQ ID NO: 187), де
X13 означає I або N,
X14 означає P;
(ii) послідовність CDR1 означає SASSSLSYIH (SEQ ID NO: 188);
(iii) послідовність FR2 являє собою WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID NO: 189);
(iv) послідовність CDR2 являє собою DTSNLAS (SEQ ID NO: 190);
(v) послідовність FR3 являє собою GIPDRFSGSGSGX15DFTLTISRVEPEDFAVYYC (SEQ ID NO: 191), де
X15 означає T або N;
(vi) послідовність CDR3 являє собою FQGSEYPLT (SEQ ID NO: 192);
(vii) послідовність FR4 являє собою FGQGTKLEIKR (SEQ ID NO: 193).
2. Антитіло за п. 1, в якому послідовність FR1 VH вибрана з групи, що складається з QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSIS (SEQ ID NO: 103), QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSIT (SEQ ID NO: 104), EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSIS (SEQ ID NO: 115), EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSIT (SEQ ID NO: 116) і EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSIT (SEQ ID NO: 122).
3. Антитіло за п. 1 або 2, в якому послідовність FR2 VH вибрана з групи, що складається з WIRQSPGKGLQWIG (SEQ ID NO: 127), WIRQSPGKGLQWMG (SEQ ID NO: 128), WIRQSPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 129), WIRQSPGKGLEWMG (SEQ ID NO: 130) і WIRQPPGKGLQWIG (SEQ ID NO:131).
4. Антитіло за будь-яким з пп. 1-3, в якому послідовність CDR2 вибрана з групи, що складається з HIHFSGRPTYNPSLSS (SEQ ID NO: 135), HIHFSGRPTYNPSLKS (SEQ ID NO: 136), HIHFSGRPTYNPSLLS (SEQ ID NO: 137), HIHFSGRPTYNPSLHS (SEQ ID NO: 138), HIHFSGRPTYNPSLFS (SEQ ID NO: 139) і HIHFSGRPTYNPSLRS (SEQ ID NO: 140).
5. Антитіло за будь-яким з пп. 1-4, в якому послідовність CDR2 являє собою HIHFSGRPTYNPSLKS (SEQ ID NO: 136).
6. Антитіло за будь-яким з п. 1-5, в якому послідовність FR3 VH вибрана з групи, що складається з RVTISRETAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: 171), RVTISKETAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: 173), RISISRDTAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: 184) і RISISKDTAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: 186).
7. Антитіло за будь-яким з пп. 1-6, яке додатково містить константний домен VH.
8. Антитіло за п. 7, в якому константний домен VH має послідовність:
ASTKNPDVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV
HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
SCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE
DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK
EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCL
VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ
QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ OID NO: 52) або
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV
HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
SCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE
DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK
EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCL
VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ
QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 92); або
ASTKNPDVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV
HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
SCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE
DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNG
KEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLT
CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 53).
9. Антитіло за будь-яким з пп. 1-8, в якому послідовність FR1 VL являє собою EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC (SEQ ID NO: 195) або ENVLTQSPGTLSLSPGERATLSC (SEQ ID NO: 197).
10. Антитіло за будь-яким з пп. 1-9, в якому послідовність FR3 VL являє собою GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRVEPEDFAVYYC (SEQ ID NO: 199) або GIPDRFSGSGSGNDFTLTISRVEPEDFAVYYC (SEQ ID NO: 200).
11. Антитіло за будь-яким з пп. 1-10, яке додатково містить константний домен VL.
12. Антитіло за п. 11, в якому константний домен VL має послідовність
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS
QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN
RGEC (SEQ ID NO: 93).
13. Антитіло за будь-яким з пп. 1-12, яке містить два зв'язувальних домени VL і два зв'язувальних домени VH, в якому послідовність зв'язувальних доменів VL являє собою послідовність, вказану в SEQ ID NO: 7, і послідовність зв'язувальних доменів VH являє собою послідовність, вказану в SEQ ID NO: 50.
14. Антитіло за будь-яким з пп. 1-12, яке містить два зв'язувальних домени VL і два зв'язувальних домени VH, в якому послідовність зв'язувальних доменів VL являє собою послідовність, вказану в SEQ ID NO: 7, і послідовність зв'язувальних доменів VH являє собою послідовність, вказану в SEQ ID NO: 94.
15. Антитіло за будь-яким з пп. 1-14, де антитіло має знижений рівень фукози.
16. Застосування антитіла за будь-яким з пп. 1-15 для приготування лікарського засобу, придатного для лікування злоякісної пухлини, яка вибрана з групи, що складається з пухлин прямої і ободової кишки, яєчника, підшлункової залози, передміхурової залози і легені.
17. Спосіб виявлення присутності злоякісних клітин в зразку in vitro, причому спосіб включає приведення зразка клітин в контакт зі зв’язувальним доменом або антитілом за будь-яким з пп. 1-15 і виявлення зв'язування антитіла з клітинами.
Текст
Реферат: Винахід належить до гуманізованого антитіла і його антигензв'язуючого домену, що специфічно зв'язується клітинами Colo205. Винахід належить до застосування антитіла або його антигензв'язуючого домену, що специфічно зв'язується клітинами Colo205 для приготування лікарського засобу, придатного для лікування злоякісних пухлин та до способу виявлення присутності злоякісних пухлин в зразку in vitro за рахунок контакту зразка клітин з антитілом або його антигензв'язуючого домену. UA 108349 C2 (12) UA 108349 C2 UA 108349 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ДАТА ПОДАЧІ ЗАЯВКИ Дана заявка пов'язана і вимагає пріоритет на основі заявки на видачу патенту Австралії № 2009901129, поданої 16 березня 2009 року, і заявки на видачу патенту США № 61/160682, поданої 16 березня 2009 року, і заявки на видачу патенту США № 61/258517, поданої 5 листопада 2009 року, повний зміст кожної з вказаних заявок включений в цей опис у вигляді посилання. ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ, ДО ЯКОЇ НАЛЕЖИТЬ ВИНАХІД Даний винахід стосується гуманізованих антитіл з високою протипухлинною активністю. Зокрема, гуманізовані антитіла мають специфічне зв’язування і безпосередньо викликають загибель клітин пухлин ободової кишки людини і виявляють високу імунно-опосередковану цитотоксичну активність проти злоякісних клітин ободової кишки людини в аналізах залежної від антитіл опосередкованої клітинами цитотоксичності (ADCC) і залежної від комплементу цитотоксичності (CDC). Крім того, даний винахід стосується застосування таких гуманізованих антитіл в терапії і діагностиці. РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Вуглеводні структури можуть являти собою специфічні для пухлини або асоційовані з пухлинами антигени і, таким чином, знаходяться в центрі уваги багатьох методик імунізації, направлених на генерування антитіл. Однак генерування специфічних противуглеводних антитіл є складною задачею, оскільки вони можуть не мати специфічність, афінність або належать тільки до класу IgM (Christensen et al., 2009). Крім того, складною задачею є утворення гуманізованих противуглеводних антитіл, які мають здатність убивати злоякісні клітини, такий факт відображується в дуже малій кількості відповідаючих на такі антитіла. Є тільки один приклад протигліколіпідного антитіла, яке було успішно гуманізоване; антитіло упізнає гангліозид GM2 і убиває пухлинні клітини людини in vitro і in vivo (патенти США №№ 6423511 і 6872392). Хоч два інших приклади зв'язуючих вуглеводи антитіл, які були сконструйовані для введення людині, є негуманізованими. По-перше, противуглеводне антитіло RAV-12 є химерним IgG1 миші-людини, яке ефективне in vitro і in vivo проти клітин злоякісної пухлини ободової кишки людини (Loo et al., 2007). По-друге, було показано, що противуглеводне антитіло HMMC-1 ефективне in vitro проти злоякісної пухлини яєчника людини. HMMC-1 є повністю людським антитілом, утворюваним у трансхромосомних мишей KM (Nozawa et al., 2004). У міжнародній заявці на видачу патенту № WO 2005/108430 розкрите мишаче моноклональне антитіло проти злоякісних пухлин, яке назване SC104. Опис вказаної заявки включений в даний документ у вигляді посилання. Точна природа антигену, з яким зв'язується SC104, не ясна, але в WO 2005/108430 указано, що антиген є сіалілтетраозилвуглеводом. Також описано, що SC104 здатне безпосередньо індукувати загибель клітин без необхідності в імунних ефекторних клітинах. СУТЬ ВИНАХОДУ У першому аспекті даний винахід стосується зв'язуючого домену V H антитіла, при цьому зв'язуючий домен містить послідовно першу каркасну область (FR1), першу CDR (CDR1), другу каркасну область (FR2), другу CDR (CDR2), третю каркасну область (FR3), третю CDR (CDR3) і четверту каркасну область (FR4), при цьому: послідовність FR1 являє собою послідовність X1VQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVX2GYSX3X4 (SEQ ID NO:95), де: X1 означає Q або Е, X2 означає S або Т, X3 означає I, L або V, X4 означає S або Т, або послідовність, щонайменше на 90% або щонайменше на 95% схожу, переважно щонайменше на 90% або щонайменше на 95% ідентичну вказаній послідовності; послідовність CDR1 являє собою SGYSWH (SEQ ID NO:96) або послідовність, щонайменше на 80% схожу, переважно щонайменше на 80% ідентичну вказаній послідовності; послідовність FR2 являє собою WIRQX5PGKGLX6WX7G (SEQ ID NO:97), де X5 означає S або Р, X6 означає Q або Е, X7 означає M або I, або послідовність, щонайменше на 90% схожу, переважно щонайменше на 90% ідентичну вказаній послідовності; послідовність CDR2 являє собою HIHX8SGRPTYX9PSLX10S (SEQ ID NO:98), де X8 означає F, Y або W, 1 UA 108349 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 X9 означає N або D, X10 означає K, L, Н, F, R або S, або послідовність, щонайменше на 90% схожу, переважно щонайменше на 90% ідентичну вказаній послідовності; послідовність FR3 являє собою RX11X12ISX13X14TAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO:99), де X11 означає V або I, X12 означає Т або S, X13 означає R або K, X14 означає Е або D, або послідовність, щонайменше на 90% або щонайменше на 95% схожу, переважно щонайменше на 90% або щонайменше на 95% ідентичну вказаній послідовності, за умови, що залишок в положенні 6 повинен бути R або K; послідовність CDR3 являє собою KGKGSDDGLNY (SEQ ID NO:100) або послідовність, щонайменше на 90% схожу, переважно щонайменше на 90% ідентичну вказаній послідовності; послідовність FR4 являє собою WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:101) або послідовність, щонайменше на 90% схожу, переважно щонайменше на 90% ідентичну вказаній послідовності. У другому аспекті даний винахід стосується зв'язуючого домену V H антитіла, при цьому зв'язуючий домен містить каркасну послідовність і першу, другу і третю CDR, розташовані в каркасній послідовності, при цьому послідовність каркасних областей щонайменше на 90%, переважно щонайменше на 95% ідентична послідовності QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSX3SWIRQPPGKGLQWIGRVTISX13ETAKNQFSLKLTSMTA ADTAVYYCARWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:102); де X3 означає I, L або V, і X13 означає R або K; і послідовність CDR1 являє собою SGYSWH (SEQ ID NO:96) або послідовність, щонайменше на 80% схожу, переважно щонайменше на 80% ідентичну вказаній послідовності; послідовність CDR2 являє собою HIHX8SGRPTYX9PSLX10S (SEQ ID NO:98), де X8 означає F, Y або W, X9 означає N або D, X10 означає K, L, Н, F, R або S, або послідовність, щонайменше на 90% схожу, переважно щонайменше на 90% ідентичну вказаній послідовності; і послідовність CDR3 являє собою KGKGSDDGLNY (SEQ ID NO:100) або послідовність, щонайменше на 90% схожу, переважно щонайменше на 90% ідентичну вказаній послідовності. У третьому аспекті даний винахід стосується зв'язуючого домену V L антитіла, при цьому зв'язуючий домен містить послідовно першу каркасну область (FR1), першу CDR (CDR1), другу каркасну область (FR2), другу CDR (CDR2), третю каркасну область (FR3), третю CDR (CDR3) і четверту каркасну область (FR4), при цьому: послідовність FR1 являє собою EX15VLTQSPGTLSLSX16GERATLSC (SEQ ID NO:187), де X15 означає I або N, X16 означає А або Р, або послідовність, щонайменше на 90% або щонайменше на 95% схожу, переважно щонайменше на 90% або щонайменше на 95% ідентичну вказаній послідовності; послідовність CDR1 являє собою SASSSLSYIH (SEQ ID NO:188) або послідовність, щонайменше на 90% схожу, переважно щонайменше на 90% ідентичну вказаній послідовності; послідовність FR2 являє собою WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID NO:189) або послідовність, щонайменше на 90% схожу, переважно щонайменше на 90% ідентичну вказаній послідовності; послідовність CDR2 являє собою DTSNLAS (SEQ ID NO:190) або послідовність, щонайменше на 80% схожу, переважно щонайменше на 80% ідентичну вказаній послідовності; послідовність FR3 являє собою GIPDRFSGSGSGX17DFTLTISRVEPEDFAVYYC (SEQ ID NO:191), де X17 означає Т або N, або послідовність, щонайменше на 90% або щонайменше на 95% схожу, переважно щонайменше на 90% або щонайменше на 95% ідентичну вказаній послідовності; послідовність CDR3 являє собою FQGSEYPLT (SEQ ID NO:192) або послідовність, щонайменше на 80% схожу, переважно щонайменше на 80% ідентичну вказаній послідовності; послідовність FR4 являє собою FGQGTKLEIKR (SEQ ID NO:193) або послідовність, щонайменше на 90% схожу, переважно щонайменше на 90% ідентичну вказаній послідовності. У четвертому аспекті даний винахід стосується зв'язуючого домену V L антитіла, при цьому зв'язуючий домен містить каркасну послідовність і першу, другу і третю CDR, розташовані в 2 UA 108349 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 каркасній послідовності, при цьому послідовність каркасних областей щонайменше на 90%, переважно щонайменше на 95% ідентична послідовності EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCWYQQKPGQAPRLLIYGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRVEPEDFAVYY CFGQGTKLEIKR (SEQ ID NO:194); і послідовність CDR1 являє собою SASSSLSYIH (SEQ ID NO:188) або послідовність, щонайменше на 90% схожу, переважно щонайменше на 90% ідентичну вказаній послідовності; послідовність CDR2 являє собою DTSNLAS (SEQ ID NO:190) або послідовність, щонайменше на 80% схожу, переважно щонайменше на 80% ідентичну вказаній послідовності; і послідовність CDR3 являє собою FQGSEYPLT (SEQ ID NO:192) або послідовність, щонайменше на 80% схожу, переважно щонайменше на 80% ідентичну вказаній послідовності. У п'ятому аспекті даний винахід стосується зв'язуючого домену V H антитіла, при цьому зв'язуючий домен містить послідовно першу каркасну область (FR1), першу CDR (CDR1), другу каркасну область (FR2), другу CDR (CDR2), третю каркасну область (FR3), третю CDR (CDR3) і четверту каркасну область (FR4), при цьому: послідовність FR1 являє собою EVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGYSX18X19 (SEQ ID NO:201), де X18 означає I, L або V, X19 означає S або Т, або послідовність, щонайменше на 90% або щонайменше на 95% схожу, переважно щонайменше на 90% або щонайменше на 95% ідентичну вказаній послідовності; послідовність CDR1 являє собою SGYSWH (SEQ ID NO:96) або послідовність, щонайменше на 80% схожу, переважно щонайменше на 80% ідентичну вказаній послідовності; послідовність FR2 являє собою WIRQPPGKGLEWX20G (SEQ ID NO:202), де X20 означає M або I, або послідовність, щонайменше на 90% схожу, переважно щонайменше на 90% ідентичну вказаній послідовності; послідовність CDR2 являє собою HIHX21SGRPTYX22PSLX23S (SEQ ID NO:98), де X21 означає F, Y або W, X22 означає N або D, X23 означає K, L, Н, F, R або S, або послідовність, щонайменше на 90% схожу, переважно щонайменше на 90% ідентичну вказаній послідовності; послідовність FR3 являє собою RX24X25ISX26DTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO:203), де X24 означає V або I, X25 означає S або Т, X26 означає R або K, або послідовність, щонайменше на 90% або щонайменше на 95% схожу, переважно щонайменше на 90% або щонайменше на 95% ідентичну вказаній послідовності, за умови, що залишок в положенні 6 повинен бути R або K; послідовність CDR3 являє собою KGKGSDDGLNY (SEQ ID NO:100) або послідовність, щонайменше на 90% схожу, переважно щонайменше на 90% ідентичну вказаній послідовності; послідовність FR4 являє собою WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:101) або послідовність, щонайменше на 90% схожу, переважно щонайменше на 90% ідентичну вказаній послідовності. У шостому аспекті даний винахід стосується зв'язуючого домену V H антитіла, при цьому зв'язуючий домен містить каркасну послідовність і першу, другу і третю CDR, розташовані в каркасній послідовності, при цьому послідовність каркасних областей щонайменше на 90%, переважно щонайменше на 95% ідентична послідовності EVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGYSX18SWIRQPPGKGLEWIGRVTISX26DTSKNQFSLKLSSVT AADTAVYYCARWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:204), де X18 означає I, L або V, і X26 означає R або K; і послідовність CDR1 являє собою SGYSWH (SEQ ID NO:96) або послідовність, щонайменше на 80% схожу, переважно щонайменше на 80% ідентичну вказаній послідовності; послідовність CDR2 являє собою HIHX21SGRPTYX22PSLX23S (SEQ ID NO:98), де X21 означає F, Y або W, X22 означає N або D, X23 означає K, L, Н, F, R або S, або послідовність, щонайменше на 90% схожу, переважно щонайменше на 90% ідентичну вказаній послідовності; і 3 UA 108349 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 послідовність CDR3 являє собою KGKGSDDGLNY (SEQ ID NO:10) або послідовність, щонайменше на 90% схожу, переважно щонайменше на 90% ідентичну вказаній послідовності. У сьомому аспекті даний винахід стосується зв'язуючого домену V L антитіла, при цьому зв'язуючий домен містить послідовно першу каркасну область (FR1), першу CDR (CDR1), другу каркасну область (FR2), другу CDR (CDR2), третю каркасну область (FR3), третю CDR (CDR3) і четверту каркасну область (FR4), при цьому: послідовність FR1 являє собою EX27VLTQSPATLSLSPGERATLSC (SEQ ID NO:211), де X27 означає I або N, або послідовність, щонайменше на 90% або щонайменше на 95% схожу, переважно щонайменше на 90% або щонайменше на 95% ідентичну вказаній послідовності; послідовність CDR1 являє собою SASSSLSYIH (SEQ ID NO:188) або послідовність, щонайменше на 90% схожу, переважно щонайменше на 90% ідентичну вказаній послідовності; послідовність FR2 являє собою WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID NO:189) або послідовність, щонайменше на 90% схожу, переважно щонайменше на 90% ідентичну вказаній послідовності; послідовність CDR2 являє собою DTSNLAS (SEQ ID NO:190) або послідовність, щонайменше на 80% схожу, переважно щонайменше на 90% ідентичну вказаній послідовності; послідовність FR3 являє собою GIPDRFSGSGSGX28DFTLTISRLEPEDFAVYYC (SEQ ID NO:212), де X28 означає Т або N, або послідовність, щонайменше на 90% або щонайменше на 95% схожу, переважно щонайменше на 90% або щонайменше на 95% ідентичну вказаній послідовності; послідовність CDR3 являє собою FQGSEYPLT (SEQ ID NO:192) або послідовність, щонайменше на 80% схожу, переважно щонайменше на 80% ідентичну вказаній послідовності; послідовність FR4 являє собою FGGGTKVEIKR (SEQ ID NO:193) або послідовність, щонайменше на 90% схожу, переважно щонайменше на 90% ідентичну вказаній послідовності. У восьмому аспекті даний винахід стосується зв'язуючого домену VL антитіла, при цьому зв'язуючий домен містить каркасну послідовність і першу, другу і третю CDR, розташовані в каркасній послідовності, при цьому послідовність каркасних областей щонайменше на 90%, переважно щонайменше на 95% ідентична послідовності EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCWYQQKPGQAPRLLIYGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYY CFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO:213), і послідовність CDR1 являє собою SASSSLSYIH (SEQ ID NO:188) або послідовність, щонайменше на 90% схожу, переважно щонайменше на 90% ідентичну вказаній послідовності; послідовність CDR2 являє собою DTSNLAS (SEQ ID NO:190) або послідовність, щонайменше на 80% схожу, переважно щонайменше на 80% ідентичну вказаній послідовності; і послідовність CDR3 являє собою FQGSEYPLT (SEQ ID NO:192) або послідовність, щонайменше на 80% схожу, переважно щонайменше на 80% ідентичну вказаній послідовності. Зв'язуючі домени згідно з даним винаходом, в тому випадку, коли вони представлені у вигляді частини антитіла, будуть зв'язувати лінію клітин злоякісної пухлини ободової кишки людини Colo205. Буде зрозуміло, що антитіло буде складатися з двох важких ланцюгів, кожний з яких містить варіабельні і константні області, і двох легких ланцюгів, кожний з яких містить варіабельні і константні області. У тому випадку, коли заявлений зв'язуючий домен являє собою зв'язуючий домен VH, антитіло, яке зв'язує лінію клітин злоякісної пухлини ободової кишки людини Colo205, буде складатися з двох заявлених зв'язуючих доменів V H, двох легких ланцюгів SEQ ID NO:7 і двох константних доменів важкого ланцюга SEQ ID NO:92 або SEQ ID NO:52. Подібним чином, коли заявлений зв'язуючий домен являє собою зв'язуючий домен V L, антитіло, яке зв'язує лінію клітин злоякісної пухлини ободової кишки людини Colo205, буде складатися з двох заявлених зв'язуючих доменів VL, двох константних доменів VL SEQ ID NO:93 і двох важких ланцюгів SEQ ID NO:94 або SEQ ID NO:50. КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ Фігура 1. Зв'язуючі активності (панелі ліворуч) і активності, що безпосередньо викликають загибель (панелі праворуч) мишачого SC104 (варіабельні домени, вказані в SEQ ID NO:3/SEQ ID NO:1) і химерного SC104 (SEQ ID NO:4/SEQ ID NO:2) антитіл і контролю ізотипу IgG1 людини відносно позитивних по антигену SC104 (C170, Colo205) і негативних по антигену SC104 (HCT116) ліній клітин злоякісної пухлини ободової кишки людини, які показані з використанням проточної цитометрії; ідентифікаційні номери послідовностей стосуються номерів, вказаних в списку послідовностей. Химерне SC104 і мишаче SC104 антитіла виявляють порівнянне вибірне зв’язування і активність, що безпосередньо викликає загибель позитивних по антигену ліній клітин злоякісної пухлини ободової кишки людини. Обидва антитіла не зв'язуються і не 4 UA 108349 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 викликають пряму загибель негативних по антигену ліній клітин злоякісної пухлини ободової кишки людини. Кожна точка представляє середнє ± SD для трьох повторів зразків. Фігура 2. Гуманізація SC104 на акцепторному каркасі людини 1U6A або 1QLR, що включає CDR-H1 згідно з визначенням Кебата (-□-), дає нефункціональні варіанти антитіла, які не зв'язуються з позитивною по антигену SC104 лінією клітин злоякісної пухлини ободової кишки людини C170. Зв'язуючі активності варіантів SC104, гуманізованих з використанням CDR-H1 згідно з визначенням Кебата, прищепленої або в акцептор людини 1U6A (SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:9, панель А), або 1QLR (SEQ ID NO:8/SEQ ID NO:10, панель В), оцінювали за допомогою проточної цитометрії, використовуючи позитивну по антигену лінію клітин C170. Химерне антитіло SC104 (SEQ ID NO:4/SEQ ID NO:2) показане як порівняльне нарівні з негативним контролем ізотипу IgG1 людини. Кожна точка представляє середнє ± SD для трьох повторів зразків. Фігура 3. Гуманізація SC104 на акцепторному каркасі людини 1U6A або 1QLR, що включає CDR-H1 (-▲-) згідно з визначенням AbM, створює варіанти антитіл, які зв'язуються з позитивною по антигену SC104 лінією клітин злоякісної пухлини ободової кишки людини C170. Активності зв’язування гуманізованих варіантів SC104, що включають CDR-H1 згідно з визначенням AbM, прищеплену або в акцептор людини 1U6A (SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:11, панель А), або в 1QLR (SEQ ID NO:8/SEQ ID NO:12, панель В), оцінювали за допомогою проточної цитометрії, використовуючи позитивну по антигену лінію клітин C170. Химерне антитіло SC104 (SEQ ID NO:4/SEQ ID NO:2) показане як порівняльне нарівні з негативним контролем ізотипу IgG1 людини. Кожна точка представляє середнє ± SD для трьох повторів зразків. Фігура 4. Аналіз амінокислотної заміни (замін) в легкому ланцюзі і важкому ланцюзі відносно посилення зв'язуючої активності 1U6A-гуманізованого SC104. Вплив замін в кожному ланцюзі аналізували в аналізах активності зв’язування з позитивною по антигену лінією клітин C170, використовуючи проточну цитометрію. Химерне антитіло SC104 (SEQ ID NO:4/SEQ ID NO:2) показане як порівняльне нарівні з негативним контролем ізотипу IgG1 людини. Кожна точка представляє середнє ± SD для трьох повторів зразків. А: щеплення, що містять CDR-H1 згідно з визначенням Кебата; послідовність SEQ ID NO:9 належить до VH, що не містить замін, послідовність SEQ ID NO:15 містить заміни в V H: Q1E, Q46E, I48M, V67I, T68S, V71R і E72D, послідовність SEQ ID NO:7 належить до V L, що включає в себе одну заміну A15P, тоді як послідовність SEQ ID NO:16 належить до V L, що містить три заміни I2N, A15P і T69N. В: щеплення, що містять CDR-H1 згідно з визначенням AbM; послідовність SEQ ID NO:11 належить до VH, що не містить замін, послідовність SEQ ID NO:13 містить заміни в V H: Q1E, Q46E, I48M, V67I, T68S, V71R і E72D, послідовність SEQ ID NO:7 належить до VL, що включає в себе одну заміну A15P, і послідовність SEQ ID NO:16 належить до V L, що містить три заміни: I2N, A15P і T69N. Амінокислотна заміна(и) у важкому ланцюзі (-□- або -○-) посилює біологічну активність 1U6Aгуманізованих варіантів антитіла SC104 відносно позитивної по антигену лінії клітин C170. У порівнянні, амінокислотні заміни в легкому ланцюзі, мабуть, менш важливі для посилення зв'язуючої активності гуманізованого SC104. Фігура 5. Аналіз шести окремих замін VH, включених в 1U6A-гуманізовані антитіла, що містять CDR-H1 згідно з визначенням AbM. Вплив замін аналізували в аналізах активності зв’язування з позитивною по антигену лінією клітин C170, використовуючи проточну цитометрію. Такі зміни являли собою або Q46E, або I48M, або V67I, або T68S, або V71R, або E72D, і вони описані в SEQ ID NO:19-24, відповідно. Заміна R71 (SEQ ID NO:23) (-○-) була найбільш успішною в посиленні ефективності зв’язування гуманізованого SC104. Химерне антитіло SC104 (SEQ ID NO:4/SEQ ID NO:2) показане як порівняльне поряд з ізотипом IgG1 людини як негативним контролем. Кожна точка представляє середнє ± SD для трьох повторів зразків. Фігура 6. VH-заміна R71 (-□- або -▲-) посилює активність зв’язування обох варіантів антитіла з CDR-H1 згідно з визначеннями AbM і Кебата з позитивною по антигену лінією клітин C170, судячи з визначення з використанням проточної цитометрії. Химерне антитіло SC104 (SEQ ID NO:4/SEQ ID NO:2) показане як порівняльне, і ізотип IgG1 людини використаний як негативний контроль. Кожна точка представляє середнє ± SD для трьох повторів зразків. А: основані на 1QLR варіанти SC104 ± заміна V71R; щеплення CDR-H1 згідно з визначенням AbM: SEQ ID NO:12 (-R) і SEQ ID NO:26 (+R); щеплення CDR-H1 згідно з визначенням Кебата: SEQ ID NO:10 (-R) і SEQ ID NO:27 (+R). В: основані на 1U6A варіанти SC104 ± заміна V71R; щеплення CDR-H1 згідно з визначенням AbM: SEQ ID NO:11 (-R) і SEQ ID NO:25 (+R); щеплення CDR-H1 згідно з визначенням Кебата: SEQ ID NO:9 (-R) і SEQ ID NO:28 (+R). 5 UA 108349 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фігура 7. Вплив на активність зв’язування VH-заміни G27Y в 1QLR-гуманізованих варіантах SC104 з CDR-H1 згідно з визначенням Кебата. Така заміна не посилює активність зв’язування 1QLR-гуманізованого SC104 (SEQ ID NO:27 (+R) і SEQ ID NO:29 (+R +Y) (-□- або -▲-) в порівнянні з AbM-CDR-H1-вмісною послідовністю VH SEQ ID NO:26) при дослідженні в аналізах зв’язування на основі проточної цитометрії з позитивною по антигену SC104 лінією клітин C170. Для порівняння показаний 1QLR-гуманізований варіант, що включає в себе CDR-H1 згідно з визначенням Кебата без R71, SEQ ID NO:10. Химерне антитіло SC104 (SEQ ID NO:4/SEQ ID NO:2) показане як порівняльне, і ізотип IgG1 людини використаний як негативний контроль. Кожна точка представляє середнє ± SD для трьох повторів зразків. Фігура 8. Оснований на проточній цитометрії аналіз зв’язування, що показує вплив на зв'язуючу активність після видалення передбачуваної сильної зв'язуючої MHC класу II пептидної послідовності на границі каркас 2:CDR-H2 за допомогою заміни F53 в CDR-H2 химерного SC104. Перехід від F53 до іншого ароматичного залишку, такого як W (SEQ ID NO:30) або Y (SEQ ID NO:31) (-□- або -○-), здійснює дуже малий вплив на активність зв’язування, тоді як заміна на переважний залишок Р (SEQ ID NO:32) сильно знижує активність зв’язування з позитивною по антигену SC104 лінією клітин C170. Химерне антитіло SC104 (SEQ ID NO:4/SEQ ID NO:2) показане як порівняльне нарівні з негативним контролем ізотипу IgG1 людини. Кожна точка представляє середнє ± SD для трьох повторів зразків. Фігура 9. Гуманізовані варіанти SC104 з більш низькою передбачуваною імуногенністю (1U6A VL/VH SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:50; 1QLR VL/VH SEQ ID NO:8/SEQ ID NO:38) порівнянні з гуманізованими варіантами антитіла з більш високою передбачуваною імуногенністю (1U6A VL/VH SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:25; 1QLR VL/VH SEQ ID NO:8/SEQ ID NO:26) відносно специфічності і активності зв’язування з позитивною по антигену (C170, Colo205) або негативною по антигену (HCT-116) лінією клітин злоякісної пухлини ободової кишки людини, судячи з визначення з використанням проточної цитометрії. Химерне антитіло SC104 (SEQ ID NO:4/SEQ ID NO:2) показане як порівняльне нарівні з негативним контролем ізотипу IgG1 людини. Кожна точка представляє середнє ± SD для трьох повторів зразків. Фігура 10. Оснований на проточній цитометрії аналіз зв’язування, який показує, що залишки I (-○-) (SEQ ID NO:50) і L (-□-) (SEQ ID NO:62), але не С (-▲-) (SEQ ID NO:55), в положенні 29 в каркасі 1 1U6A варіабельної області важкого ланцюга надають більш високу активність зв’язування гуманізованих варіантів антитіла SC104 з більш низькою передбачуваною імуногенністю з позитивною по антигену SC104 лінією клітин злоякісної пухлини ободової кишки людини C170. Химерне антитіло SC104 (SEQ ID NO:4/SEQ ID NO:2) показане як порівняльне нарівні з негативним контролем ізотипу IgG1 людини. Кожна точка представляє середнє ± SD для трьох повторів зразків. Фігура 11. Оснований на проточній цитометрії аналіз зв’язування, який показує, що позитивно заряджені залишки R (SEQ ID NO:50) (-□-), але не негативно заряджений залишок D (SEQ ID NO:75) (-▲-) або нейтральний залишок W (SEQ ID NO:90) (- -), в положенні 71 в каркасі 3 1U6A варіабельної області важкого ланцюга надають більш високу активність зв’язування гуманізованих варіантів антитіла SC104 з більш низькою передбачуваною імуногенністю з позитивною по антигену SC104 лінією клітин злоякісної пухлини ободової кишки людини C170. Химерне антитіло SC104 (SEQ ID NO:4/SEQ ID NO:2) показане як порівняльне нарівні з негативним контролем ізотипу IgG1 людини. Кожна точка представляє середнє ± SD для трьох повторів зразків. Фігура 12. Варіанти антитіла SC104, що містять каркас 1U6A (V L/VH SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:50 і SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:25) (-□- або - -), мають більш високу активність, що безпосередньо викликає загибель клітин, в порівнянні з відповідними варіантами SC104, одержаними на основі 1QLR (VL/VH SEQ ID NO:8/SEQ ID NO:38 і SEQ ID NO:8/SEQ ID NO:26), судячи з визначення за допомогою проточної цитометрії з використанням позитивної по антигену SC104 лінії клітин злоякісної пухлини ободової кишки людини C170. Химерне антитіло SC104 (SEQ ID NO:4/SEQ ID NO:2) показане як порівняльне нарівні з негативним контролем ізотипу IgG1 людини. Кожна точка представляє середнє ± SD для трьох повторів зразків. Фігура 13. Гуманізовані варіанти антитіла SC104, що містять каркас 1U6A (VL/VH SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:50 і SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:25) (-□- або - -), мають більш високу залежну від антитіл опосередковану клітинами цитотоксичну активністю в порівнянні з відповідними одержаними на основі 1QLR варіантами SC104 (VL/VH SEQ ID NO:8/SEQ ID NO:38 і SEQ ID NO:8/SEQ ID NO:26), як визначено в аналізах вивільнення LDH з використанням позитивної по антигену SC104 лінії клітин злоякісної пухлини ободової кишки людини C170. Химерне антитіло SC104 (SEQ ID NO:4/SEQ ID NO:2) показане як порівняльне, і ізотип IgG1 людини використаний як негативний контроль. Кожна точка представляє середнє ± SD для трьох повторів зразків. 6 UA 108349 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фігура 14. Варіанти антитіла SC104, що містять каркас 1U6A (V L/VH SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:50 і SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:25) (-□- або - -), мають більш високу залежну від комплементу цитотоксичність в порівнянні з відповідними одержаними на основі 1QLR варіантами антитіла SC104 (VL/VH SEQ ID NO:8/SEQ ID NO:38 і SEQ ID NO:8/SEQ ID NO:26), як визначено в аналізах життєздатності клітин з використанням позитивної по антигену SC104 лінії клітин злоякісної пухлини ободової кишки людини Colo205. Химерне антитіло SC104 (SEQ ID NO:4/SEQ ID NO:2) показане як порівняльне нарівні з негативним контролем у вигляді ізотипу IgG1 людини. Кожна точка представляє середнє ± SD для трьох повторів зразків. Фігура 15. Оброблене кіфунензином гуманізоване антитіло SC104 з більш низькою передбачуваною імуногенністю (SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:50) (-○-) має більш високу залежну від антитіл опосередковану клітинами цитотоксичну активність в порівнянні з необробленим антитілом (-▲-), як визначено в аналізах вивільнення LDH з використанням позитивної по антигену SC104 лінії клітин злоякісної пухлини ободової кишки людини WiDr. Кожна точка представляє середнє ± SD для трьох повторів зразків. Фігура 16. Сконструйоване способом Potelligent® гуманізоване антитіло SC104 з більш низькою передбачуваною імуногенністю (SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:94) (-○-) має більш високу залежну від антитіл опосередковану клітинами цитотоксичну активність в порівнянні з необробленим антитілом (SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:50), як визначено в аналізах вивільнення LDH з використанням позитивної по антигену SC104 лінії клітин злоякісної пухлини ободової кишки людини Colo201. Кожна точка представляє середнє ± SD для трьох повторів зразків. Фігура 17. Обробка мишей, що несуть ксенотрансплантат пухлини HT29, гуманізованим антитілом SC104 з більш низькою передбачуваною імуногенністю (-○-) (SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:50) приводить до значущо зниженого росту в порівнянні з контрольною обробкою наповнювачем. Верхня панель: середнє значення ± SEM об'єму пухлини в групах по 6-10 мишей. Зірочками вказані значущі відмінності між групами обробки, р
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюHumanised antibodies with anti-tumour activity
Автори англійськоюKienzle, Norbert, Alexander, Clarke, Adam, William, Doyle, Anthony, Gerard, Jennings, Philip, Anthony, Pollard, Matthew
Автори російськоюКинцле Норберт Александер, Кларк Адам Уилльям, Дойл Энтони Джерард, Дженнингз Филип Энтони, Поллард Мэттью
МПК / Мітки
МПК: A61P 35/00, A61K 39/395, C07K 16/30
Мітки: активністю, протипухлинною, гуманізоване, антитіло
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/283-108349-gumanizovane-antitilo-z-protipukhlinnoyu-aktivnistyu.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Гуманізоване антитіло з протипухлинною активністю</a>
Попередній патент: Ген bacillus thuringiensis з активністю проти lepidoptera
Наступний патент: Спосіб отримання похідного дигідропіримідину
Випадковий патент: Плоский катод на основі діоксиду марганцю, що має можливість багаторазового перезарядження і придатний для використання у лужному акумуляторі