Штам гриба реnісіllіuм funісulоsuм тном, 1237-продуцент пектінєстерази з нуклеазною активністю

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству ферментов, и представляет собой штамм гриба, отобранный по признаку внеклеточного синтеза пектинэстеразы, который может быть использован в кондитерской, соковой и винодельческой отраслях промышленности для получения низкометоксилированного пектина, пектовой кислоты, осветления яблочного и лимонного соков, с целью стабилизации вин, а также благодаря наличию нуклеазной активности, в сельском хозяйстве в качестве безвредного средства защиты растений, в медицине как лекарственный препарат с противовирусным и иммуномоделирующим действием. Процесс деметилирования пектиновых веществ, происходящий с образованием пектиновой кислоты, осуществляется при участии фермента пектинэстеразы (ПЭ), Низкометоксилированный пектин является эффективным гелеобразующим агентом, необходимым в кондитерской отрасли пищевой промышленности для приготовления желе, мармеладов, джемов, и пр. Присутствие пектинэстеразы ускоряет процесс извлечения сока из фруктовых и овощных кашиц, содействует очистке соков. Пектинэ-стеразная активность (П э Ак ) характеризует способность фермента катализировать гидролиз сложно-эфирных связей в молекуле пектина. Известны штаммы микроорганизмов-продуцентов комплекса пектолитических Ферментов: AsperglHus awamori 16, Asperglllus foetldus 45; Clostrldium pectlnofermentans, AsperglHus foetldus 27; Erwlnla chrysantheml. Секреция природными изолятами микроорганизмов отдельного фермента комплекса - чрезвычайно редкое свойство. Во всемирно известном Каталоге органических и биохимических веществ и диагностических реагентов фирмы "Sigma" публикуются данные по ферментным препаратам различного происхождения, в том числе по пектинэ-стеразе из томатов и кожуры апельсинов, однако "51дта"не сообщает о продуценте пектинэстеразы грибного происхождения, что говорит об отсутствии эффективного микробного продуцента этого фермента. Наиболее близким к предлагаемому является штамм гриба Penicllllum fellutanum, 57699 - продуцент пектинэстеразы (5). Однако гриб P.fellutanum, 57699 продуцирует не один, а комплекс пектолитических ферментов с преобладанием пектинэстераз-ного компонента (с активностью пектинэстеразы, равной 172,5-180 ед/г), получение которого связано с дополнительными затратами на очистку пектинэстеразы от сопутствующи х ферментов комплекса - эндо- и экзополигалактуроназ. Кроме того, P.fellutanum, 57699 обладает значительно меньшей способностью к синтезу внеклеточных нуклеодеполимераз (около 30 ед/мл РНКазы) по сравнению с предлагаемым (в среднем 850 ед/мл РНКазы) штаммом. Задача изобретения - получение нового штамма гриба-продуцента пектинэстеразы с высоким выходом, обладающего нуклеаз-ной активностью. Поставленная задача решается тем, что в качестве продуцента пектинэстеразы с нукле-азной активностью используется штамм гриба Penicllllum funlculosum Thorn, 1237. Штамм гриба Penicilllum funlculosum, 1237 выделен из отходов переработки яблок Айзенберг В .Л. и идентифицирован В.А. За харченко. Проводился пересев наиболее активных по пектинэстеразе вариантов с агаризованной минеральной среды, содержащей в качестве единственного источника углерода яблочные выжимки. Культура обладает стабилизированной устойчивостью по активности, пектинэстеразы. Штамм хранится в коллекции культур отдела физиологии и систематики микромицентов Института микробиологии НАН Украины под номером 1237. Полученный из предполагаемого штамма препарат в 1,2-1,4 раза превосходит препарат из P.fellutanum, 57699 по величине пектинэстеразной активности. Наличие у предполагаемого штамма нуклеазной активности, т.е. фермента, гид-ролизирующего, в частности, рибонуклеиновую (РНКаза) кислоту, например вирусной природы, представляет помимо научного (исследование свойств новых грибных н уклеаз) практический интерес (противовирусные препараты для защиты растений, медицинские иммуномоделирующие и противовирусные препараты). Согласно "Sigma" в США налажено производство ферментных препаратов РНКаз, например РНКазы CL3 из печени цыпленка с активностью 50-2000 ед-мл; нуклеазы PI из Penicilllum cltrlnum с активностью 300 ед/мл. Штамм гриба P. funlcullosum Thorn, 1237 характеризуется следующими культураль-но-морфологическими свойствами. Культурально-морфологические свойства гриба Penlclllium funlcullosum Thorn, 1237, Гриб растет хорошо и спороносит на агаризованных средах. На агаризованной среде Чапека на 10-й день роста при 26°С колонии пушисто-войлочные, с хорошо заметными тяжами гиф.в центральной части, с ровным краем, вначале белые, светложелто-ватые, при старении серовато-зеленые, с нижнейстороны светлосоломенные. Спо-роношение регулярное. Конидиеносцы 20-30 х 2,2-3,0 мкм отходят отгифальных тяжей или от субстракта в краевой зоны, гладкие неокрашенные. Кисточки типично двухъярусные и симметрические. Метули 9,0-11,0 х 2,0-2,5 мкм по 5-7 в пучке. Конидии эллиптические до почти шаровидных 2,2-3,2 х 2,0-2,4 мкм, со сравнительно толстой оболочкой гладкие или мелкошероховатые, в сплетающихся цепочках. Штамм хорошо растет и спороносит на искусственных питательных средах (сусловом агаре, картофельно-глюкозном агаре), синтетических (среда Сабуро), на питательных субстрактах из зерен хлебных злаков (рис, просо), слабо спороносит на агаризованной среде Чапека. Физиолого-биохимические свойства гриба Penlcillum funlcullosum Thorn, 1237. Гриб усваивает глюкозу, галактозу, фр уктозу, мальтозу, са харозу, крахмал, сорбит, маннит, инулин, янтарную и яблочную кислоты. Усваивает нитратный, нитритный, лучше аммонийный азот. Ассимилирует мочевину, пептон, кукурузный экстракт, солодовые ростки, мелассу. Аэроб антитоксичный. Растет в широких границах рН 2-9. В процессе роста подкисляет среду до рН 3,0. Оптимальная температура роста 20-30°С. Максимум образования фермента пектинэстеразы в культуральной жидкости (к.ж.) при глубинном культивировании гриба на жидкой питательной среде с яблочными выжимками либо со свекловичным жомом (или с его водным 89,15% экстрактом с добавлением 10% водного экстракта солодовых ростков) в качестве индукторов фермента наблюдается на 60-ом часу, максимум нуклеазной активности -на среде другого состава - среде Чапека с глюкозой - на 48-м часу глубинного культивирования. Величина пектинэстеразной активности у гриба P.funicullosum Thom, 1237 при выращивании на средах со свекловичным жомом и яблочными выжимками достигает пика к 60-му часу, оставаясь в тех же пределах к 70-му часу роста (230-250 ед/г) и постепенно снижаясь при дальнейшем культивировании гриба до 80-100 ед/г к 96-му часу роста. Что касается нуклеазной активности, то ее значения, достигнув максимума на 48-ой час культивирования (около 850 ед/мл), составляют к 60-му часу роста около 500 ед/мл, а к 70-му - около 300 ед/мл. Следует подчеркнуть, что на средах с яблочными выжимками и свекловичным жомом нуклеазная активность у гриба P.funicillosumThom, 1237 отсутствует; ее образование отмечено только на среде Чапека с глюкозой. Пектинэстеразную активность определяют по тестированной методике в стандартных условия х и выражают в микроэквивалентах (мкэкв) прогидролизованных слож-ноэфирных связей в молекуле пектина за 1 мин при 30°С. Активность рибонуклеазы - фермента, расщепляющего полимерную молекулу рибонуклеиновой кислоты (РНК) на низкомоле-кулярные фрагменты - моно- и олигонуклеотиды - определяют спектрофотомет-рически при длине волны 260 нм. Пример 1. Для получения посевного материала (инокулюма) при наработке ферментных препаратов в лабораторных и производственных условиях культур у гриба P.funlcullosum Thom, 1237 выращивают глубинным способом при 30°С в колбах объемом 750 мл со 150 мл среды на круговой качалке с 220 об/мин в течение 30 часов. При приготовлении инокулюма и основной ферментационной среды выращивание гриба проводят на жидкой минеральной среде состава (%): калий фосфорнокислый одно-замещенный -0,1; калий хлористый 0,05; магний сернокислый - 0,05; аммоний серно-кислый - 0,5; яблочные выжимки - 4,0; вода водопроводная 100 мл. Ферментационную среду, засеянную 10% инокулюмом, культивируют глубинным способом при 30°С в течение 60 часов в колбах объемом 750 мл на круговой качалке с 220 об/мин или в производственных ферментерах при 30°С со скоростью вращений мешалки 250 об/мин и аэрацией 1,0-1,5 объема воздуха на 1 л суспензии в 1 мин. Ферментный препарат пектинэстеразы получают из к.ж. гриба (отделенной от биомассы и нерастворимых примесей центрифугированием) осаждением тремя объемами ацетона на один объем к.ж. Осадок центрифугир уют при 3000 об/мин в течение 20 мин и сушат, Величина активности ферментного препарата пектинэстеразы из гриба P.funicullocum Thom, 1237 составляет 250 ед/г (т.е. в 1,4 раза выше, чем у прототипа), удельная активность - около 30 ед/мг белка. Препарат пектинэстеразы из P.funicullosum Thom, 1237 свободен отэндопо-лигалактурозной и эзополигалактуроназной активности. Пример 2. Для получения инокулюма культуру гриба P.funicullosum Thom, 1237 выращивают глубинным способом при 30°С в колбах объемом 750 мл со 150 мл среды на круговой качалке с 220 об/мин втечение 30 часов. При приготовлении инокулюма и основной ферментационной среды выращивание гриба проводят на'жидкой минеральной среде состава (%): калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,3: калий хлористый 0,05; магний сернокислый - 0,05; калий азотнокислый - 0,2; железо сернокислое - 0,001; свекловичный жом 4,0; вода водопроводная - 100 мл. Ферментационную среду, засеянную 10% инокулюмом, культивируют глубинным способом при 30°С в течение 60 часов в колбах объемом 750 мл на круговой качалке с 220 об/мин или в производственных ферментерах при 30°С со скоростью вращения мешалки 250 об/мин и аэрацией 1,0-1,5 объема воздуха на 1 л суспензии в 1 мин. Ферментный препарат пектинэстеразы получают из к.ж. гриба (отделенной от биомассы и нерастворимых примесей центрифугированием) осаждением тремя объемами ацетона на один объем к,ж. Осадок центрифугир уют при 3000 об/мин в течение 200 мин и сушат. Величина активности ферментного препарата пектинэстеразы из гриба P.funlcullosum Thom, 1237 составляет 230 ед/г (т.е. в 1,2 раза выше, чем у прототипа), удельная активность - около 28 ед/мг белка. Примерз. Для получения инокулюма культуру гриба P.funlcullosum Thom, 1237 выращивают глубинным способом при 30°С в колбах объемом 750 мл со 150 мл среды на круговой качалке с 220 об/мин в течение 24 часов. При приготовлении инокулюма и основной ферментационной среды выращивание гриба проводят на жидкой минеральной cреде Чапека состава (%): калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,1; калий хлористый - 0,05; магний сернокислый - 0,05; калий азотнокислый - 0,2; железо сернокислое - 0,001; глюкоза 2,0; вода водопроводная - 100 мл. Ферментационную среду, засеянную 10% инокулюмом, культивируют глубинным способом при 28°С в течение 48 часов в колбах объемом 750 мл на круговой качалке с 220 об/мин. Величина активности РНКазы в к.ж, гриба P.funlcullosum Thorn, 1237 составляет в среднем 850 ед/г, что в 28 раз выше, чем у прототипа, и в 2,5-1,5 раз выше по сравнению с некоторыми известными источниками нуклеаз. Из сказанного следует, что с помощью предлагаемого штамма гриба P.funlcullosum Thom, 1237 можно осуществить производство двух препаратов: пектинэстеразы и нуклеазы. Штамм гриба P.funlcullosum Thom, 1237 проверен на токсичность в Украинском научно исследовательском институте экогиги-ены и токсикологии химических веществ. Таким образом, штамм гриба P.funlcullosum Thom, 1237 по сравнению с известным характеризуется более высоким выходом целевого продукта-фермента пектинэстеразы, обладает нуклеазной активностью и представляет собой новую культуру со стойкими физиолого-морфологическими свойствами,