Спосіб прогнозування ускладнень після хірургічної корекції мілкого присінку порожнини рота

Спосіб прогнозування ускладнень після хірургічної корекції мілкого присінку, що включає проведення комплексу клініко-діагностичних досліджень, забір досліджуваного матеріалу та його обробку, який відрізняється тим, що як досліджуваний матеріал використовують біоптат слизової оболонки в області прикріпленої частини ясен і здійснюють вивчення морфологічної та ультраструктурної 3 ної та ультраструктурної організації фібробластів підслизового шару ясен шляхом проведення їх імуногістохімічних та гістологічних досліджень, імуногістохімічне дослідження фібробластів, виконують після виготовлення з біоптату клітинної суспензії, за допомогою реакції моноклональних мишачих антитіл до фібробластів людини (Dako Cytomation, США), гістологічне дослідження виконують після забарвлення зрізів гематоксилінзозином та по Маллорі з наступним підрахуванням кількості фібробластів з урахуванням ступеню глибини присінку порожнини рота і проводять визначення ступеню проліферативної активності фібробластів, при підвищеному ступені проліферативної активності фібробластів у досліджуваному матеріалі, прогнозують можливість ускладнення, а саме, утворення рубцевої деформації після хірургічного втручання. Запропонований спосіб прогнозування ускладнень після хірургічної корекції мілкого присінку здійснюють наступним чином. Після проведення комплексу клініко-діагностичних досліджень, виконують забір досліджуваного матеріалу. Матеріал для дослідження одержують шляхом біопсії слизової оболонки в області прикріпленої частини ясен, після проведення інфільтраційної анастезії . Розмір біоптата 1,5х 1,5 мм. Біопсія проводиться поза зоною прикріплення вуздечки нижньої губи, відступаючи від неї на 3 мм вправо. Потім біоптант розміщують у пробірку з фіз. розчином. Для імуногістохімічного дослідження частину одержаного біоптанта розміщують у культуральний флакон з поживним середовищем яке складається із розчину Ігла (90мл), сироватки крупного рогатого скота (5мл), пуповидної сироватки людини (5мл), глютаміну (ЗОмл), канаміцину (40мл). (строк зберігання 3-4 діб при t + 4C°). Потім біоптат переміщують у стерільну чашку Петрі з невеликою кількістю поживної речовини і стерільним пінцетом подрібнювали його на частки розміром з булавовидну голівку. За допомогою вигнутої препарувальної голки частинки біоптату виймають з поживної середи і розміщують на покривному скельці, яке знаходиться у культуральному флаконі і накривають їх покривним скельцем, наливаючи поживну речовину таким чином, щоб вона закривала верхнє скельце. Покривні скельця за допомогою пінцету накладають на бокову сторону культурального флакону, щільно закривають пробкою і інкубують у термостаті при 37С, через тиждень з добовою періодичністю проглядають культуру під мікроскопом, повертаючи флакон і досліджуючи прилиплі до бокової стінки скельця з культурою при малому збільшенні. При появі зони росту клітин змінюють середовище. Якщо клітини займають увесь простір між часточками, виготовляють клітинну суспензію фібробластів: видаляють поживну речовину із флакону і наливали підігрітий 0,25 % розчин трипсину на дві хвилини потім трипсин виливають, залишаючи його лише між скельцями та інкубують культуру протягом 20 хвилин у термостаті при 37С° і після закінчення трипсинізації відділяють одне скельце від іншого за допомогою препарувальної голки. За допомогою тонко відтягнутої 18110 4 піпетки виконують змивання клінин невеликою кількістю (1 мл) поживного розчину, ретельно пікетуючи суспензію клітин. Для відмивки та підготовки роботи на проточному цитофлюориметрі клітинну суспензію переносять до центрифужної пробірки і центрифугують при 1500 об/хв протягом 10 хв. Відбирають над осадову рідину, добавляють фосфатно-солевий буфер (рН 7,2), ресуспензують осад и знову центрифугують, двічі повторюючи відмивку клітин. До відмитого осаду добавляють фосфатно-солевий буфер, ресуспензують осад і розливають клітинну суспензію у еппендорфи по 0,1 мл. Склад фосфатно-солевого буферу рН 7,2 на 1л дистильованої води (NaCl - 7,82 г.,КН2РО4 0,25 г., Na2HPO4 -1,16г). До двох пробирок по 0,1мл клітинної суспензії уФСБ добавляють 1,5 мкл флюорисцентного барвника-5-(6)- карбоксифлюорисцеін-диацетат та інкубують при температурі 37 С продовж Юхвилин. Після цього клітини відмивають шляхом центрифугування з Імл ФСБ при 1,5 тис. об/хв протягом 5хвилин. Потім ресуспензують клітини 1й пробирці, фіксують 4% розчином параформальдегіду тривалістю 10 хв. при температурі 4°С°. Пермабілізацію проводять за допомогою 0,1% розчину сапонину. Післе 2-х разової відмивки клітини нкубують із 5 мкл антитіл до фибробластів при 37С° тривалістю 20 хв. Після одноразової відмивки до ресуспензированих клітин добавляють 2 мкл 2-х позначених фикоеритрином. Инкубацію клітин проводять при 37°С тривалістю 209хв., до ресуспензованих клітин 1-ої проби добавляють 0,5 мл ФСБ і аналізують на проточному цитофлюориметрі. До другої проби після інкубації с КФДА добавляють 0,2 мл поживного середовища і инкубують при 37С протягом 48годин. Після вторинної відмивки процес повторюють з 2-го етапу сз наступним аналізом на проточному цитофлюориметрі. Аналіз проводять на проточному цитофлюориметрі ERJX LX - MCL (Beckman Coulter,CIIIA), з використанням програми System || tm software. Для збуждення флюорисценції використовують аргоновьій лазер із довжиною хвилі 488км. Додатково до флюорисцентних параметрів проводять реєстрацію прямого и бокового світлороссіювача клітин, що дозволяє виключити з аналізу конгломерати клітин та їх уламки. Підрахунок клітин проводять протягом 300 секунд, при цьому кількість проаналізованих клітин у пробі в пробе складає від 15 до 20 тьіс. Імуногістохімічне дослідження фібробластів, отриманих із клітинної суспензії, проводять за допомогою моноклональних мишачих антитіл до фібробластів людини (Dako Cytomation, США). Принцип іммуногістохімічного дослідження полягає в імунологичній реакції моноклональних антитіл (мк AT) КЛОН проти певногго тканевого антигену. Первинний мк Ат визначали за допомогою вторинних антитіл, конюгованих із біотином проти Fc імуноглобулінів (EXTRA-2, Sigma, USA), потім зрізи обробляють стрептавідін пероксидазним комплексом, який прикріплюється до біотиніловим комплексам антиген-антитіло, розчепляють хромоген (аміноетилкарбазол, діамінобензидин (Sigma, 5 18110 USA) і дає забарвлення в місці локалізації комплексу антиген-антитіло, що забезпечує візуалізацію реакції. Для гістологічного дослідження біоптат слизової оболонки порожнини рота фіксують у 10% розчині нейтрального формаліну і заключають у парафін по загальновідомій методиці. Зрізи депарафінують і забарвлюють гематоксилінзозином та по Маллорі з наступним підрахуванням кількості фібробластів з урахуванням ступеню глибини присінку порожнини рота і проводять визначення ступеню проліферативної активності фібробластів, при підвищеному ступені проліферативної активності фібробластів у досліджуваном матеріалі, прогнозують можливість ускладнення, утворення рубцевої деформації після хірургічного втручання . Приклад 1. Запропонований спосіб прогнозування ускладнень після хірургічної корекції мілкого присінку проводили пацієнту Н. 19років, із зубощелепною аномалією, мілким присінком порожнини рота та гінгівітом. Після проведення комплексу клініко-діагностичних досліджень виконували інфільтраційну анестезію у ділянці прікріпленої частини ясен виконували забір досліджуваного матеріалу. Матеріал для дослідження одержують шляхом біопсії слизової оболонки в області прикріпленої частини ясен. Розмір біоптата 1,5х1,5мм. Біопсія проводиться поза зоною прикріплення вуздечки нижньої губи, відступаючи від неї на 3мм вправо. Потім одержаний біоптат розміщували у пробірку з Комп’ютерна верстка Д. Шеверун 6 фізіологічним розчином і виконували імуногістохімічнех та гістологічне дослідженя відповідно до запропонованого способу. Імуногістохімічне дослідження фібробластів, виконували з клітинної суспензії біоптату, за допомогою реакції моноклональних мишачих антитіл до фібробластів людини (Dako Cytomation, США), гістологічне дослідження виконували після забарвлення зрізів гематоксилінзозином та по Маллорі. Підраховували кількість фібробластів з урахуванням ступеню глибини присінку порожнини рота та визначали ступінь проліферативної активності фібробластів. У досліджуваному матеріалі було виявлено підвищену ступінь проліферативної активності фібробластів, що дає змогу прогнозувати можливість ускладнення, а саме, утворення рубцевої деформації після хірургічного втручання. Запропонованим способом прогнозування ускладнень після хірургічної корекції мілкого присінку було досліджено 5 пацієнтів віком 18-25 років з наявністю зубощелепної аномалії, мілким присінком порожнини рота та гінгівітом. Всім пацієнтам до вестибулопластики проводили обстеження запропонованим способом, що дало змогу запобігти утворення рубцевої деформації після хірургічного втручання, шляхом своєчасного проведення профілактичних заходів. Запропонований спосіб прогнозування достатньо інформативний і забезпечує високий ступінь достовірності прогнозування. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601