Контейнер для запліднення яйцеклітин

Изобретение относится к контейнеру для оплодотворения яйцеклеток человека. Оплодотворение "ин витро" яйцеклеток человека является очень сложным методом, который позволил решить проблему в случаях бесплодия, которое было до настоящего времени необратимым. С первого рождения в 1978 г. Луиса Брауна, проведенного группой Эдвардса из Англии, тысячи детей были рождены во всем мире с использованием этого метода. Главной целью при работе группы оплодотворения "ин витро" было всегда упрощение как методики, так и применяемых устройств при сохранении или улучшении результатов. Именно на этой основе в клинической практике появились: - стимуляция с целью получения нескольких яйцеклеток и увеличения таким образом шансов на успех, - другие варианты пункции, отличные от пункции под контролем эндоскопии брюшной полости, в частности, под эхографическим трансвезикальным контролем и, наконец, трансуретральным контролем, которые позволяют обойтись без общей анестезии и избежать возможной токсикации СО2. В плане биологическом, замораживание сверхкомплектных эмбрионов позволило улучшить результаты. Ли шь сам этап биологического оплодотворения подвергался незначительным модификациям. Этот биологический этап до сегодняшнего дня остается очень сложным. Классически он соответствовал аэробной и стерильной культуре эмбрионов в коробке или трубке при 37°С и при содержиаании СО2 в количестве 5%. Это требует наличия коробок и трубок с отсутствием герметичности при риске отравления окружающей средой. Отсюда следует необходимость иметь термостат с СО2 или инкубатор (разработка фирмы "Тестар"), обеспечивающих строгое соблюдение режима по температуре в 37°С и по содержанию СО2. Это оборудование является сложным и дорогостоящим. Кроме того, первоначально после пункции обеспечивали фазу созревания яйцеклеток от 1 до 4 часов в среде комплементированной культуры, чаще всего в человеческой сыворотке, а после этого срока оплодотворение яйцеклеток после смены среды; через 18-24 часа выполнялось обнажение зародышей. {Это обнажение соответствует механическому снятию кумулюсных клеток, окружающих зародыш, с целью оценки стадии развития). Зародыш переносился в новую среду, которая через 20-24 часа, после этого была вновь сменена перед помещением его в маточную полость, что соответствовало использованию более 3 мл среды культуры зародышем и многочисленным последовательным манипуляциям в течение 48 часов, что могло создать токсикацию для этих зародышей. Из публикации Ж. Салат-Бару и др. "Оплодотворение в пробирке", 1982, с.2681-2685, известен контейнер для оплодотворения яйцеклеток, содержащий пробирку для размещения в ней культурной среды и винтовую пробку. Задачей изобретения является создание контейнера для оплодотворения яйцеклеток, обеспечивающего стерильность среды в предоперационный период. Поставленная задача решается за счет того, что контейнер для оплодотворения яйцеклеток, содержащий цилиндрическую пробирку для размещения в ней культурной среды и винтовую пробку, согласно изобретению, снабжен мембраной, установленной над входным отверстием в пробирку, а пробка имеет герметизирующую прокладку, размещенную с вн утренней стороны на донной ее части, при этом культурная среда расположена в пробирке с сохранением воздушного объема. Так же, согласно изобретению, воздушный объем контейнера составляет 200 мкл; пробирка имеет длину 4-4,5 см, наружный диаметр 1,5-1,7 см, а ее внутренний объем составляет 3,2-5 см; контейнер имеет дополнительную герметизирующую прокладку, размещенную с наружной стороны пробирки по ее периметру и выполненную с возможностью взаимодействия с торцевой поверхностью крышки; наружные диаметры дополнительной герметизирующей прокладки и пробки соответствуют наружному диаметру пробирки; герметизирующая прокладка и пробка имеют в своей центральной части выпуклую поверхность, диаметр которой равен диаметру входного отверстия в пробирку; культурная среда представляет среду В2 Менезо. Хотя культурная среда представляет собой текучую среду, она является составной частью используемого контейнера, поскольку мембрана будет противодействовать изменению количества жидкости и ее состояния от изготовления до использования. На фиг.1 показана модель контейнера для оплодотворения яйцеклеток; на фиг.2 -закрепляющее устройство для удержания трубки в вагинальной полости. Это цилиндрическая пробирка 1 небольших размеров с гладкими и закругленными стенками с целью избежания травм вагинальной слизистой оболочки. Пробирка 1 имеет длину приблизительно 4 см при внешнем диаметре в 1,5 см; толщина стенок составляет 2 мм на корпусе цилиндра 2, за исключением уровня горловины 3, где она составляет не более 1 мм, что обеспечивает внутреннюю полость в 1,1 см диаметром на длине 3,8 см с полезным объемом приблизительно в 3,2см 3. Этот объем соответствует культуре в 4-5 эмбрионов. Для числа эмбрионов, превышающего пять, используемый объем среды может быть увеличен до 5 см 3, тогда внешние размеры составляют 4,5 см длины при внешнем диаметре 1,7 см, а толщина стенок остается неизменной. Могут быть рассмотрены также и другие формы пробирки (кроме цилиндрической): грушевидная, круглая или изогнутая форма в зависимости от вагинальной полости. На внешней стенке пробирки должна быть предусмотрена поверхность для записи фамилии пациентки. Такая же запись на внешней стенке пробирки ограничивает ошибки асептии. Вследствие уменьшения толщины стенки горловины 3 внешний край 4 завинченной пробки не выступает за стенку пробки. Глухой конец 5 трубки скруглен. Верхний, конец 6 пробирки, связанный с горловиной, является плоским и имеет в центре круглое отверстие 7 диаметром приблизительно 4 мм. Именно через это отверстие вводятся яйцеклетки и необходимые для оплодотворения сперматозоиды. Размеры отверстия сознательно занижены по отношению к диаметру пробирки с целью ограничения обменов среды культуры с окружающим воздухом и, следовательно, минимизации возмущений. Для еще большего уменьшения септических рисков, возмущений среды и снижения времени манипуляций представляется полезным разработать контейнеры, в которых среда культуры помещается в полость 8 пробирки с момента ее изготовления. Для избежания биохимических возмущений среды или отравлений в течение срока, разделяющего приготовление и использование, реализуется герметичное закрытие трубки тонкой мембраной 9, перекрывающей отверстие. Эта мембрана изготавливается таким образом, чтобы она могла быть легко разорвана в момент помещения яйцеклетки и сперматозоидов в трубку с помощью "пипетки Пастера" из стекла или наконечника пипетки из пластмассы одноразового пользования. Могут быть использованы и другие примеры герметизации, например, применение системы, снабженной клапаном. Средой культуры может быть одна из классически применяемых и имеющихся в продаже. В данному случае используется среда "l.N,R.A, De Menezo", известная на рынке под названием "В2" фирмы "A.P.I. Systeme". Между поверхностью среды и мембраной сохраняется лишь малый газовый объем Ί0 приблизительно в 200 мкл, который соответствует объему переносимых яйцеклеток и сперматозоидов. Внутренние стенки 11 пробирки должны быть совершенно гладкими и скругленными с целью предотвращения прилипания яйцеклеток при отборе для их переноса в маточную полость. Пробка 12 высотой 1 см и диаметром 1,5 см завинчивается на горловину пробирки для закрытия отверстия. После разрыва мембраны 9 необходимо, тем не менее, обеспечить надежную герметичность пробирки для предотвращения возмущений среды и возможных загрязнений при ее помещении в вагинальную полость. Эта герметичность обеспечивается двумя прокладками, одна из которых 13 корончатого типа зажимает горловину пробирки толщиной приблизительно 1 мм, другая, плоская и круглая 14, покрывающая днище пробки, с идентичной толщиной. Для дополнительного обеспечения герметичности днище пробки имеет в середине выпуклость 15, диаметр которой равен диаметру отверстия. Прокладка 14 также может иметь выпуклость, повторяющую форму днища пробки, что позволяет в процессе завинчивания пробки более плотно прижать прокладку к отверстию тр убки. Внешняя стенка пробки имеет скругленные края 16. Применяемым для реализации материалом является жесткая пластмасса, имеющая большую механическую прочность (но без возможности травмирования), типа полипропилена, не являющегося токсичным для клеточных культур. Стерильные контейнеры и среда упаковываются индивидуально в стерильную упаковку типа целлофановой бумаги, в процессе упаковки пробка полностью не завинчивается с целью избежания разрыва мембраны. Закрепляющее устройство, обеспечивающее удержание пробирки в вагинальной полости, показано на фиг.2. Э то устройство состоит из гибкого кольца, в состав которого входит металлическая пластина 17, на которую нанесена резиновая оболочка 18, к которой крепится небольшой резиновый карманчик 19 размера пробирки, который позволяет поместить ее туда. Диаметр этого кольца будет определен, как для диафрагмы, для каждой пациентки в зависимости от размера ее маточной полости и шейки матки во время консультации перед оплодотворением "ин витро". Это устройство позволяет удержать пробирку в задней части вагинальной сумки без риска для пациентки потерять ее или переохладить среду культуры в связи со слишком близким расположением по отношению к отверстию влагалища. Мероприятия, которые позволили предложить это устройство, базируются на результатах наблюдений и исследовательских работах. Первый из этих результатов, наблюдаемый на протяжении 6 месяцев, состоит в том, что часть среды, сохраняемая в стерильной герметически закрытой трубке, по возможности без допуска воздуха, позволяет сохранять ее более 10 дней без возмущений и без того, чтобы ее использование изменило бы классически полученные результаты. Второй результат базируется на исследованиях оплодотворения 3 яйцеклеток, помещенных в одну и ту же опытную емкость, т.е. в 1 мл среды; он показывает получение процента расслоения, идентичного классически получаемому процентному соотношению, когда культивируется одна яйцеклетка на каждый опыт. Фактом является также то обстоятельство, что если одна яйцеклетка остается в одном и том же опытном объеме в течение 48 часов, необходимых для оплодотворения, яйцеклетка не взаимодействует ни с чем на этой стадии своего развития. Наконец, многочисленные исследования, выполненные фирмой "Menezo", продемонстрировали минимальные изменения среды культуры перед и после оплодотворения. Комплекс этих результатов привел к выполнению предварительных исследований, которые обеспечили прогресс, несмотря на то, что число пациенток, число яйцеклеток и соответствующи х зародышей было малым, причем первоначальные результаты были весьма обнадеживающими. Первое исследование было реализовано на 8 пациентах, а число яйцеклеток превышало 4 на пункцию. Приблизительно половина полученных зародышей культивировались классическим образом, а другая половина - в герметично закрытой пробирке в течение 48 часов в термостате. Не было отмечено какой-либо разницы по степени расслоения. Две пациентки забеременели, что соответствует классически полученному проценту успеха. Вторая серия из 8 пациенток имела 4 яйцеклетки на пункцию, из которых половина культивировалась классическим образом, а другая половина - внутриматочным введением пробирки, содержащей зародыш. Здесь еще процент расслоения оставался эквивалентным и даже немного превосходил метод интравагинальной культуры. 5 из эти х пациенток забеременели.