Спосіб оцінки стану системи мати-плацента-плід у вагітних з наявністю урогенітальних інфекцій

Спосіб оцінки стану системи мати-плацентаплід у вагітни х з наявністю урогенітальних інфекцій шляхом лабораторних досліджень, який відрі 3 21076 оцінюють зміни у стані системи мати - плацента плід як патологічні. Відомо, що хламідії - це кокові грамнегативні патогенні бактерії, які є облігатними внутрішньоклітинними паразитами еукаріотичних клітин. Клітини хламідій не здатні синтезувати власну аденозинтрифосфатну кислоту (АТФ), у них відсутній ряд біосинтетичних процесів, тому вони використовують ' амінокислоти та деякі нуклеозидтрифосфати, в тому числі АТФ, клітини господаря. Перебуваючи в середині клітини-господаря, хламідії здатні впливати на її ліпідний склад. Так, у складі ПМ хламідійної везикули було виявлено гліцерофосфоліпіди, характерні для еукаріотичної клітини-господаря, що свідчить про їх перехід із ПМо до ендосоми паразита. Хламідії також використовують фосфатидилсерин клітини-господаря для синтезу власного фосфатидилетаноламіну шляхом декарбоксилювання [3]. Порушення хімічного складу мембрани і активності мембранозв'язаного ферменту зумовлено проникненням у клітину-господаря хламідійної інфекції. Ступінь молекулярної рухливості (текучість) всередині ліпідної частини мембрани важлива для регуляції активності мембранозв'язаних білків. Зміни в органічному складі досліджуваних мембран можуть бути однією з основних причин, які зумовлюють зміни в активності мембранозв'язаного ферменту Na+, К+-АТФази. Відомо, що хімічний склад ліпідного оточення мембран є одним із факторів, які суттєво впливають на активність олігомерних АТФаз. Запропонований спосіб оцінки стану системи мати-плацента-плід простий, дешевий, зручний для виконання, не вимагає дорогої апаратури, дає можливість розкрити причини трансплацентарного інфікування плода. Спосіб здійснюють наступним чином. З плаценти вагітної жінки виділяють ПМ епітеліальних клітин ворсинкового хоріону і визначають основні фракції ліпідів у біопробах та визначають Na+, K+-АТФазну активність. Під впливом хламідійної інфекції у ліпідному складі ПМ епітеліальних клітин хоріону плаценти спостерігаються зміни, що спричинюють взаємно протилежні ефекти на Na+, К+-АТФазну активність. Але зважаючи на її двохкратне пригнічення, домінуючим впливом на активність ферменту є знижений вміст фосфоліпідів. Лабораторними дослідженнями гизначено, що рівень фосфоліпідів становить 898,9±57,1нмоль фосфоліпіду/мг (у здорових вагі тних 1149,3±59,3), лізофосфоліпідів -36,2±4,3нмоль фосфоліпіду/мг (у здорових ва гітних -24,5± 3,2), Na+, К+-АТФазної активності - 23,2±1,9нмоль Фн/хв.•мг білка (у здорових ва гітних 45,2±5,3нмоль Фн/хв.•мг білка). Виявлене гальмування Na+, К+-АТФазної активності спричинює зміни іонного гомеостазу клітини, з наступним порушенням низки метаболічних реакцій епітеліальних клітин плаценти і виступає одним із ключових механізмів патогенезу. Приклад здійснення способу. Шматок ворсинкового хоріону відмивають від крові буфером 1 (20мМ NаНСО3 рН 8,1) і насухо висушують фільтрувальним папером. Ворсинковий 4 епітеліальний хоріон відшкрібають скальпелем від сполучної тканини і великих кровоносних судин. Наважку ворсинок переносять в гомогенізатор і гомогенізують протягом 10 хв. в о холодженому буфері 1 (об'єм буферу 1 повинен у 13 разів перевищува ти наважку ворсинок в г). До о триманого гомогенату додають 7 об'ємів буферу 2 (за відношенням до гомогенату) такого складу: 10мМ NаНСО3 рН 8,1 і відфільтровують через 4 шари марлі. Фільтрат центрифугують на центрифузі ОПН-8 протягом 10 хв. при 1500 g (4000об/хв..) в охолодженому роторі. Надосадову рідину обережно зливають, а до осаду додають 5,5 об'ємів (в мл) сахарози І (70,74% з густиною 1,26г/см 3) і обережно ресуспендують у гомогенізаторі (2-3 ходи). У центрифужні пробірки об'ємом 34мл вносять 10 мл суспензії, на яку обережно нашаровують 7 мл сахарози II (48,45%, з густиною 1,18 г/см 3) і 17мл сахарози III (42,90%, з густиною 1,16г/см 3). Потім проводять ультрацентрифугування при 66000g (27500об/хв..) протягом 60 хв. на УЦП 2-85 в роторі РПУ 30Б при температурі 4°С. Після закінчення центрифугування із пробірок шприцом відбирають сірувато-біле кільце між. сахарозою II і III, до зібраної фракції додають 4 об'єми охолодженого буфер у 2 (по відношенню до об'єму фракції ПМ) і центрифугують при 1500g (4000об/хв..) 10 хвилин в охолодженому роторі для відмивання від сахарози. Отриманий осад ресуспендують в 1 мл середовища для зберігання мембран наступного складу: 1/4 гліцерину, 3/4 буферу 2. Фракцію, збагачену плазматичними мембранами мікроворсинок, зберігають у пластикових пробірках в рідкому азоті. Вміст білка в одержаному препараті визначають за методом Лоурі. Ступінь очистки фракції ізольованих мембран мікроворсинок від інших мембранних фракцій контролюють за активністю маркерних ферментів Na+, К+-АТФази. Визначають основні фракції ліпідів у біопробах. Хроматографічний розподіл загальних ліпідів здійснюють на пластинах "Silufol" розміром 15х15см, попередньо активованих впродовж години в термостаті при 110°С. У хроматографічну камеру, для кращого її насичення парами, вносять фільтрувальний папір і наливають суміш розчинників: гексан-діетиловий ефір. Для кількісної оцінки ліпідів використовують денситометр ДО-1М. Попередньо будують калібрувальні криві (при довжині хвилі світла 620нм) на певні групи або класи ліпідів, використовуючи стандартні свідки - речовини, розчинені в бензолі з розрахунку 1мг/мл. Концентрацію ліпідів в біопробах розраховують в мг на 100мл біорідини (в мг %), а динаміку змін їх вмісту в епітеліальних клітинах плаценти виражають в мкг/мл суспензії і перераховують у нмоль/мг білка ПМ. Визначають Na+, К+-АТФазну активність за різницею між загальною АТФазною активністю і активністю у середовищі, яке містить її специфічний інгібітор - уабаїн. Уміст мембранного препарату в реакційній суміші становить ~50мкг (за білком по Лоурі) на 0,5мл середовища інкубації. 5 21076 Реакцію проводять в інкубаційному середовищі наступного складу: 100мМ NaCI, 20мМ КС1, 5мМ MgCl2, 0,5мМ ЕДТА, 5.10-7 SDS, 50мМ ТрисНС1 буфер; рН 7,4 при 37°С протягом 10 хв. Для цього у пробірки, що знаходиться на крижаній бані вносять суспензію мембран, 0,1 мл інкубаційного середовища, до складу якого входить: 500мМ NaCI, 100мМ КС1, 25мМ MgCl2, 0,25мМ ЕДТА, 250мМ Трис-НСІ. В одну серію проб вносять 0,1 мл 1•10-3 М уабаїну (кінцева концентрація в пробі становить 1•10-4 М). Об'єм проб доводять дистильованою водою до 0,4 мл. Ініціюють реакцію додаванням 5мМ АТФ, інкубацію проводять протягом 10 хв. при 37°С у водяному термостаті. Реакцію зупиняють додаванням 27,7% трихлороцтової кислоти (кінцева концентрація в пробірці становить 5,5 %) і поміщають проби на крижану баню. Кількість неорганічного фосфату, що виділився в процесі ферментативної реакції, визначають спектрофотометричне при довжині хвилі 660 нм. Na+, К+-АТФазну активність виражають у нмоль Фн/(мг білка • хв..). У вагітних жінок з наявністю хламідійного інфікування вдвічі знижується Na+, К+-АТФазна активність ПМ епітеліальних клітин плаценти. Комп’ютерна в ерстка Д. Шев ерун 6 Наслідком порушення Na+, К+-АТФазної активності може бути зниження градієнту концентрації іонів натрію та калію на плазматичній мембрані. Запропонований спосіб оцінки змін у системі мати-плацента- плід при урогенітальному інфікуванні є неінвазивним і простим визначенням, не потребує великих матеріальних затрат, розкриває механізми можливого висхідного інфікування плода при урогенітальних інфекціях у вагітни х на клітинному рівні. Джерела інформації: 1. Цхай В.Б., Волков Н.А., Голубцов. Возможности ультразвуковых методов исследования (эхографии, кардиотокографии, допплерографии) в диагностике внутриутробного инфицирования // Ультразвуковая диагностика в акушерстве, гинекологии и педиатрии. - 2000. - № 2. Т.8. С. 89-93. 2. Судакова Н.М. Морфологическая характеристика плаценты у беременных с хроническим пиелонефритом и урогенитальным хламидиозом // Ар х. патологии. - 2004. - № 5. - С. 21- 24. 3. Raulston J.E., Davis C.H., Schmiel D.H., Morgan M.W. and Wyrick P.B. Molecular characterization and outer membrane association of a chlamydia trachomatis pritein related to the hps 70 family of proteins // J. Biol. Chem. - 1993. - Vol. 268, №31.-P. 23139-23147. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601