Спосіб підготовки ядровмісних клітин пуповинної крові до кріоконсервування

Спосіб підготовки ядровмісних клітин пуповинної крові до кріоконсервування шляхом фракціонування пуповинної крові і концентрації клітин, який відрізняється тим, що фракціонування пуповинної крові і концентрацію ядровмісних клітин здійснюють одночасно з їх гіпотермічною адаптацією до умов заморожування під захистом кріопротектора диметилсульфоксид в 5 % концентрації, при цьому застосовують розчин Гекодезу. (19) (21) u200610727 (22) 10.10.2006 (24) 15.03.2007 (46) 15.03.2007, Бюл. № 3, 2007 р. (72) Перехрестенко Петро Михайлович, Глухенька Галина Тимофіївна, Калиниченко Тетяна Олексіївна (73) ІНСТИТУТ ГЕМАТОЛОГІЇ ТА ТРАНСФУЗІОЛОГІЇ АМН УКРАЇНИ 3 21507 лекулярним заміщенням 0,5) в розчині хлориду натрію в воді для ін'єкцій (ізотонічний розчин). Зазначений розчин додають в основний контейнер з кров'ю у співвідношенні пуповинна кров/ „Гекодез", що дорівнює 1:1. Суміш ретельно ресуспендують і залишають з метою вільного осадження на 30-50 хвилин в гіпотермічних умовах (температура осадження 4° С). Після повного осідання еритроцитів, прозорий шар з ядровмісними клітинами за допомогою плазмоекстрактора переливають у другий (пустий) контейнер системи. Концентрацію клітинної зависі проводять шляхом її центрифугування в рефрижераторній центрифузі при температурі 4°С. Дві третини надосаду, що при цьому утворюється, переливають у третій (пустий) контейнер системи. Ядровмісні клітини ресуспендують у залишку надосаду, до якого у співвідношенні 1:1 (об/об) додають охолоджений розчин кріопротектору ДМСО у концентрації 10% і ресуспендують. Концентрат ядровмісних клітин пуповинної крові після перенесення в кріоконтейнери або кріоампули (процедура перенесення проводиться в гіпотермічних умовах і займає до 20 хвилин) - готовий до програмного заморожування. Приклад 1. Пуповинну кров за прототипом змішували з розчином „Стабізол" у співвідношенні 1 частина розчину на 1 частину стабілізованої крові. Відстоювали 40 хвилин при кімнатній температурі. Видаляли еритроцитарний осад. Надосад з ядровмісними клітинами центрифугували протягом 10 хвилин зі швидкістю 1500об/хв. Видаляли дві третини надосаду, отриманий осад ядровмісних клітин ресуспендували в надосаді, що залишився. 4 До приготовленого концентрату ядровмісних клітин додавали 10% - й розчин ДМСО у співвідношенні 1:1 (об/об). Всі маніпуляції проводили при кімнатній температурі. Через 20 хвилин експозиції з розчином кріопротектора проводили оцінку збереженості ядровмісних клітин методом суправітального забарвлення 0,1% розчином трипанового синього та підрахунку кількості ядровмісних і мононуклеарних клітин. Приклад 2. Пуповинну кров за способом, що заявляється, змішували з розчином „Гекодез" у співвідношенні 1 частина розчину на 1 частину стабілізованої крові. Відстоювали 40 хвилин в гіпотермічних умовах при температурі 4°С. Видаляли еритроцитарний осад. Надосад з ядровмісними клітинами центрифугували протягом 10 хвилин зі швидкістю 1500об/хв в рефрижераторній центрифузі при температурі 4°С. Видаляли дві третини надосаду, отриманий осад ядровмісних клітин ресуспендували в надосаді, що залишився. До приготовленого концентрату ядровмісних клітин додавали охолоджений до температури 4°С 10% -й розчин ДМСО у співвідношенні 1:1 (об/об). Через 20 хвилин експозиції з розчином кріопротектора при температурі 4°С проводили оцінку збереженості ядровмісних клітин методом суправітального забарвлення 0,1% розчином трипанового синього та підрахунку кількості ядровмісних і мононуклеарних клітин. Відтворення процедур за прикладом 1 і прикладом 2 проводили паралельно в однакових аліквотах (5мл) зразків пуповинної крові. Отримані результати представлені в таблиці 1. Таблиця 1 Збереженість підготовлених за прототипом і способом, що заявляється, ядровмісних клітин пуповинної крові після експозиції з кріопротектором ДМСО № досліду 1 1 2 3 4 5 Показник Приклад* 2 І II І II І II І II І II Збереженість цитоплазматичних мембран, % 3 85 95 88 96 84 97 83 94 89 97 Кількість ядровмісних клітин, × 106 4 58,06 59,70 56,29 58,80 67,51 64,81 61,31 75,55 43,91 47,90 Кількість мононуклеарів, × 106 5 26,69 27,85 32,42 30,1 44,63 46,6 36,46 37,6 19,92 20,76 *Примітка: І - прототип; II - спосіб, що заявляється. Результати, представлені в таблиці, свідчать про наявність суттєвої різниці в результатах, що отримані при застосування двох способів. При застосуванні способу, що заявляється, суттєво збільшується збереженість мембран клітин порівняно з прототипом, а також просліджується тенденція до збільшення кількісної збереженості ядровмісних як ядровмісних, так і мононуклеарних клітин. З метою виявлення впливу умов передпідготовки ядровмісних клітин на їх збереженість після кріоконсервування, додатково було проведене одночасне заморожування-відтаювання (умови стадій заморожування-відтаювання) іден 5 21507 тичні) підготовлених за прототипом (приклад 1) і способом, що заявляється (приклад 2), суспензій 6 клітин. Результпти представлені в таблиці 2. Таблиця 2 Збереженість підготовлених до заморожування за прототипом і способом, що заявляється, ядровмісних клітин пуповинної крові після заморожування-відтаювання під захистом ДМСО № досліду 1 1 2 3 4 5 Показник Приклад* 2 І II І II І II І II І II Збереженість цитоплазматичних мембран,% 3 80 94 78 94 75 96 74 94 76 96 Кількість ядровмісних клітин, × 106 4 44,29 57,47 44,44 57,00 52,58 69,13 50,82 74,78 37,23 45,95 Кількість мононуклеарів, × 106 5 25,07 27,85 30,43 32,77 41,44 46,10 34,97 37,6 19,10 20,55 *Примітка: І - прототип; II - спосіб, що заявляється. Досліди засвідчують наявність суттєвої різниці в результатах, отриманих різними способами. Спостерігається суттєве зменшення збереженості як клітинних мембран, так і кількісного складу ядровмісних і мононуклеарних клітин при застосуванні способу прототипу у порівнянні з випадком застосування способу, що заявляється. Таким чином, спосіб, що заявляється дозволяє збільшити вихід ядровмісних клітин, мононуклеарів та проценту їх життєздатності (збереженості клітинних мембран) завдяки введенню процедури холодової адаптації; зменшити собівартість процедури фракціонування пуповинної крові за рахунок використання плазмозамінюючого розчину вітчизняного виробництва; зменшити час процедури передпідготовки до кріоконсервування шляхом об'єднання двох етапів, що є підготовчими до кріоконсервування. Комп’ютерна в ерстка Д. Шев ерун Джерела інформації 1. Bertolini F., Lazzari L., Lauri E. A comparative study o-f different procedures for the collection and banking of umbilical cord blood// J/ Hematother. 1995. - N 4. -P. 29-36. 2. Lee Y.H., Park J.S., Choi A.H. et al. Cord blood processing by gelatin sedimentation provides better yields of progenitor cells than by conventional or modified Ficoll-Hypaque method// Blood. - 1997. V.90, N10 (suppl. 1).- P.213a 3. Патент № 42599A UA A01N1/00, 1/02, AK35/14 (Перехрестенко П.М., Глухенька Г.Т., Калиниченко Т.О., Алгазінова М.К., Настенко О.П.) 3. № 2001042650, Заявл. 19.04.2001. Опубл. 15.10.2001. Спосіб кріоконсервування та підготовки до трансфузії гемопоетичних клітин кордової крові// Бюл. № 9. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601