Спосіб одержання афінних сорбентів для очищення лектинів

Корисна модель належить до біотехнології та біохімії, а саме до одержання афінних сорбентів, які використовуються для очищення лектинів. Існують способи одержання афінних сорбентів на основі природних полісахаридів і глікопротеїнів, у яких для одержання афінних сорбентів використовують поперечно-зшиті глікопротеїни яєчного білку [1], співполімери частково-гідролізованого крохмалю та дріжджевого манану [2], або співполімер полі-L-лейцину з групоспецифічною речовиною А+Н з шлунку свині [3]. Найближчим до запропонованої корисної моделі за технічною суттю є спосіб одержання афінних сорбентів, у якому використовують співполімери агар-агару та групоспецифічних речовин крові людини Н, А або В [4]. Відповідно до цього способу афінний сорбент готують наступним чином. 2г порошку муцину, одержаного з кисти яєчника людини, і 2г порошку агар-агару розмішують в 11мл води до зникнення грудок, додають 10мл води, знову розмішують і залишають у вологій камері на 12 год. Після цього суміш обережно нагрівають і перемішують до розплавлення агар-агару. Суміш охолоджують до 70-60°С, додають 11мл 10%-ного NaOH і старанно перемішують. Потім додають 3,2мл епіхлоргідрину, розмішують до гомогенного стану і залишають при 40-45°С на 1 год. В одержаній масі кінцева концентрація NaOH складає 3%, а епіхлоргідрину - 10%. Утворений гель подрібнюють, промивають невеликою кількістю води, нейтралізують і обробляють тріс(оксиметил)амінометаном до рН 9,5. Суміш залишають на 12 год для блокування остаточних епоксигруп. Після цього гель подрібнюють до часточок 0,1-0,3мм, завантажують в хроматографічну колонку і врівноважують буферним розчином. До недоліків гелю, о триманого таким способом, відноситься недостатня однорідність гелю внаслідок нерозчинності у воді групоспецифічного муцину, висока неспецифічна сорбція фенольних сполук та зниження сорбційної здатності через використання при полімеризації гідроксилів вуглеводів, які приймають участь у сорбції лектинів. Крім того, гель, одержаний за прототипом, є менш стійким у зберіганні, оскільки використовує полісахаридну матрицю, яка є чутлива до мікроорганізмів. Завданням корисної моделі є підвищення сорбційної здатності афінного сорбента по відношенню до лектинів та підвищення чистоти одержаних лектинів. Поставлене завдання досягається тим, що у способі одержання афінних сорбентів для очищення лектинів, що включає використання групоспецифічних речовин крові людини Н, А або В, згідно з корисною моделлю, афінні сорбенти одержують шляхом співполімеризації частково гідролізованих трипсином групоспецифічних речовин крові людини з полівініловим спиртом за допомогою глютарового альдегіду в кислому середовищі. Використання полівінілового спирту в якості матриці сорбенту обумовлене тим, що він легко полімеризує в присутності диальдегідів і утворений полімер є достатньо механічно і хімічно стійкий в діапазоні рН 1-14 та температур (0-100°С). Перевагою його над полісахаридними матрицями (агароза, сефадекси) є більша стійкість до руйнування мікроорганізмами. Спосіб одержання афінного сорбенту здійснюють таким чином. Рідину кисти яєчника людини, відповідної групи крові, одержану за кистектомії, очищають шляхом центрифугування протягом 30хв при 10000g. До прозорої надосадової рідини додають два об'єми етанолу, старанно перемішують і утворений осад збирають центрифугуванням 15хв при 5500g. Осад послідовно промивають 96° етанолом, ацетоном та диетиловим ефіром, після чого висушують. 5г висушеного порошку групоспецифічної речовини крові людини (групи О(Н), А або В) розтирають в ступці і просіюють через сито розміром пор 0,5мм. Його розмішують з 50мл забуференого фізіологічного розчину (ЗФР), рН 7,4 на мішалці при температурі 37°С. Через 30хв розмішування до в'язкої суспензії додають 300мг трипсину і продовжують перемішувати при тій же температурі протягом 30-50хв до розчинення основної маси групоспецифічної речовини. Утворену суміш після цього нагрівають на водяній лазні до температури 80-90°С для денатурації трипсину і після цього центрифугують 10хв при 5500g. Групоспецифічну речовин у осаджують трьома об'ємами етанолу, промивають ацетоном, ефіром і висушують. Як правило, одержується близько половини речовини від початково взятої. 2г відповідної гр упоспецифічної речовини розчиняють в 50мл води і додають 5г порошку полівінілового спирту, який розчиняють при нагріванні на водяній лазні. До розчину, нагрітого до температури 60-70°С додають 2мл 25% глютарового альдегіду, перемішують, а тоді додають 2мл 100% мурашиної кислоти. Через 10-15хв утворюється твердий гель, який розмелюють на міксері і просіюють через сито. Нестандартні часточки видаляють декілька-разовою декантацією. Для блокування залишкових альдегідних груп утворений сорбент обробляють 1% розчином тріс(оксиметил)амінометану. Після цього гелем заповнюють хроматографічну колонку, промивають відповідним буферним розчином і використовують для очищення лектинів. Найкраще з цією метою використовувати 0 ,05-0,2М ацета тні або фосфа тні буферні розчини з додаванням 1М NaCl, рН яких лежить в діапазоні 6,0-7,8. Гель можна застосовувати багатократно, його зберігають у водному розчині з консервантом (0,1-1% азид натрію, мертіолат, 1% фенол, тощо). Відповідно до груп крові людини є доцільним використання трьох типів сорбентів, одержаних з групоспецифічних речовин Н, А і В, які можуть бути використані для очищення як групоспецифічних лектинів, так і лектинів, неспецифічних до груп крові людини. Сорбційну здатність одержаного афінного сорбента досліджували наступним чином. Сорбентом, одержаним за способом, описаним в прототипі, та одержаним за пропонованим способом, заповнювали дві хроматографічні колонки, рівні за об'ємом та висотою. На обидві наносили екстракт, який містив лектин з визначеним титром аглютинації, до якого додавали 1М розчин NaCl. Пропускання екстракту через колонку проводили з однаковою швидкістю, яка залежала від об'єму колонки. Збирали фракції рідини, що витікала, і визначали у ній титр гемаглютинації. Всі фракції, у яких спостерігалась аглютинація, після проведення хроматографії об'єднували і обчислювали баланс кількості нанесеного та затриманого на колонці лектину. Гель, на якому за рівних умов сорбувалась більша кількість лектину, характеризувався вищою сорбційною здатністю. Приклади використання способу. Приклад 1. Очищення лектину кори Laburnum anagyroides Medik. Цей лектин виявляє найбільшу спорідненість до групоспецифічної речовини Н крові людини, тому для його очищення необхідно використовувати гель, виготовлений на основі групоспецифічної речовини Н. 200г повітряно-сухої кори Laburnum anagyroides Medik, зібраної під час весняного сокоруху, подрібненої до часточок менше 0,5мм, екстрагують 1,4л ЗФР (1:7) протягом 1 год при безперервному перемішуванні при кімнатній температурі. Екстракт відтискають через щільну тканину і центрифугують 10хв при 2000g протягом 10хв. Далі рН у надосадовій рідині доводять до 3,6-4,0 за допомогою 1н. НСl утворений осад видаляють центрифугуванням. Після цього рН доводять до 7,5-8,5 і невеликий осад, що при цьому утворюється, знову видаляють центрифугуванням. У надосадовій рідині рН доводять до 6,4—7,4, і лектин осаджують сульфатом амонію в діапазоні 30-80% насичення солі. Осад розчиняють в невеликій кількості води (30-40мл),ставлять на 1-2 год на діаліз проти води. Після діалізу центрифугують або фільтрують та визначають титр гемаглютинації з еритроцитами людини. Розчин лектину розділяють на дві рівні порції, додають NaCl до досягнення 1М концентрації і наносять на дві рівні за розмірами хроматографічні колонки, заповнені гелями, одержаними за способом, описаним в прототипі та одержаним за пропонованим способом. Зокрема, у даному прикладі використовували гель об'ємом 10мл, висотою 6см, попередньо врівноважений ЗФР, рН 7,4 з 1M NaCl. Пропускання розчину, який містить лектин, здійснюють повільно із швидкістю 0,5мл за хвилину, збираючи фракції по 2-3мл, у яких визначають титр гемаглютинації. Всі фракції, які пройшли хроматографічн у колонку і у яких спостерігалась аглютинація, після проведення хроматографії об'єдн ують і обчислюють баланс кількості нанесеного та затриманого на колонці лектину. Після завершення пропускання розчину, що містив лектин, колонки промивають ЗФР до зниження оптичної густини при 280нм у рідині, що витікає менше 0,1, що визначають на спектрофотометрі, і сорбований лектин елюють 1% розчином L-фукози або 5% розчином D-фруктози, які додають до ЗФР. Фракції, що містять білок, об'єднують, доводять до рН 6-7, визначають об'єм і титр гемаглютинації, після чого висолюють сульфатом амонію при 80%-ному насиченні солі. Осад збирають центрифугуванням, обезсолюють діалізом і ліофільно висушують. Кількість лектину на стадіях очищення виражали в умовних гемаглютинуючих одиницях, які визначали як добуток об'єму на титр гемаглютинації. Наприклад, якщо титр гемаглютинації є 1:128, а об'єм 5мл, то це становить 128X5=640 у. г. о. (умовних гемаглютинуючи х одиниць). Дані обчислень наведені в таблиці 1. Таблиця. 1 Очищення лектину з кори Laburnum anagyroides Medik на афінному сорбенті Стадія очищення 1 2. 3. 4. Початковий екстракт Концентрований сульфатом амонію екстракт до нанесення на колонку Лектин, що не затримався на колонці Лектин, елюйований з колонки Баланс кількості лектину по стадіях очишення Прототип Пропонований сорбент У.г.о. % У.г.о. % 10560 100 10560 100 9216 87,2 9216 87,2 2490 23,5 1350 12,7 5913 56 7340 69,5 Примітка: у. г. о. - умовних гемаглютинуючи х одиниць. Таким чином, унаслідок вищої сорбційної здатності пропонованого гелю досягається більший вихід цільового продукту. Приклад 2. Очищення лектину з листків і стебел омели білої. Лектин з листків та стебел омели білої традиційно очищають на частково гідролізованій сефарозі, однак сорбційна здатність її є невисокою. Цей лектин може бути очи щений також на групоспецифічних речовинах крові людини; з них найви щою сорбційною здатністю володіє гель на основі імобілізованої речовини В, проте, при використанні гелю, виготовленого за прототипом, одержаний лекгин є забруднений фенольними речовинами, які присутні у великій кількості в екстракті з листків та стебел омели. У той же час, використання запропонованого сорбента, виготовленого шля хом співполімеризації полі вінілового спирту та гр упоспецифічної речовини В крові людини, забезпечує низьку неспецифічну сорбцію (як у випадку частково гідролізованої сефарози), так і високу сорбційну ємність, яка є до того ж вищою, ніж при застосуванні гелю-прототипу. Сировиною служать листки і гілки омели, зібрані пізньої осені або узимку. Матеріал подрібнюють у м'ясорубці і розмішують у триразовій (по об'єму) кількості 1% розчину NaCl. Суміш перемішують 3—4 год, після чого рідину відтискають через тканину і центрифугують. Отриманий екстракт підкисляють до рН 4,0 за допомогою 5н НС1 і осад видаляють центрифугуванням при 2000g протягом 15хв. Надосадову рідину збирають і нейтралізують до рН 7,5. Невеликий осад видаляють центрифугуванням, додають NaCl до досягнення 1М концентрації і наносять на колонку афінного сорбента, попередньо урівноваженого ЗФР з 1М NaCl, рН 7,4. Зокрема, у даному прикладі використовували гель об'ємом 50мл, висотою 5см, що був попередньо врівноважений вищезгаданим буфером. Екстракт було одержано розмелюванням 2,0кг листів і гілок омели білої. Пропускання розчину, який містить лектин, здійснюють повільно із швидкістю 100-150мл за год, збираючи фракції по 300мл, у яких визначають титр гемаглютинації з еритроцитами людини або кролика. Використання еритроцитів кролика є більш бажаним, оскільки титр гемаглютинації у них є у 8-16 разів вищий. Після проходження всієї кількості екстракту колонку промивають ЗФР до ти х пір, поки в рідині, що витікає, оптична густина, виміряна при 280нм, не знизиться до значення 0,1. Всі фракції, які пройшли хроматографічн у колонку і у яких спостерігалась аглютинація, після проведення хроматографії об'єднують і обчислюють баланс кількості нанесеного та затриманого на колонці лектину. Лектин з колонки афінного гелю елюють за допомогою 2% розчину лактози, яку розчиняють в буферному розчині. Фракції, які містять лектин, об'єднують і висолюють амонієм сульфатом. У випадку використання сорбента, одержаного за прототипом, з колонки витікає рідина жовтуватого кольору, що свідчить про забруднення її фенольними речовинами; у випадку використання сорбента, запропонованого нами, з колонки витікає повністю безбарвний розчин, що свідчить про відсутність забруднення його фенольними речовинами. Дані обчислень наведені в таблиці 2. Таблиця. 2 Очищення лектину омели білої (Viscum album L.) на афінному сорбенті Стадія очищення 1 2. 3. Початковий екстракт Лектин, що не затримався на колонці Лектин, елюйований з колонки Баланс кількості лектину по стадіях очищення Прототип Пропонований сорбент У.г.о. % У.г.о. % 92800 100 92800 100 11400 12,3 5800 6,25 55913 60,2 67340 72,6 Примітка: у. г. о. - умовних гемаглютинуючи х одиниць. Приклад 3. Очищення лектину з плодових тіл хряща-молочника гірчака (Lactarius rufus /Scop ex Fr./Fr.) Одержаний афінний сорбент може бути використаний для очищення лектинів, які взаємодіють з групоспецифічними речовинами крові людини, спосіб одержання яких в літературі не описаний. Наприклад, у екстракті з плодови х тіл Lactarius rufus /Scop ex Fr./Fr.) спостерігається висока гемаглютинуюча активність, що обумовлена наявністю лектину. Цей лектин виявляє дещо вищу спорідненість до групоспецифічної речовини В крові людини і може бути очищений на сорбенті, виготовленому на основі групоспецифічної речовини В. 200г свіжих грибів розмелюють у міксері з 400мл ЗФР до гомогенного стану, одержаний гомогенат центрифугують 10хв при 6000g і осад нерозчинних часточок відкидають, а надосадову рідину фільтр ують через вату. Потім рН надосадової рідини обережно 2н. ацетатною кислотою доводять до 5,0 і утворений осад видаляють центрифугуванням. Після цього рН доводять до 7,0, додають NaCl до досягнення 1 М концентрації солі, вимірюють титр гемаглютинації екстракту з еритроцитами людини і наносять на афінний сорбент. Попередньо 30мл афінного сорбента врівноважують вищезгаданим буферним розчином з рН 6,0-7,6. Після проходження через сорбент всього об'єму екстракту його промивають ЗФР з додаванням 1 М NaCl до зниження оптичної густини при 280нм у рідині, що витікає до значення