Спосіб визначення вірусів

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно вирусологии, и может быть использовано при диагностике вирусных заболеваний. Вирусные инфекции составляют более 90% всей зарегистрированной инфекционной патологии. В системе противоэпидемических лечебно-профилактических мероприятий при вирусных заболеваниях основную роль играет лабораторная диагностика. Поэтому возрос интерес к быстрым, точным и простым вирусологическим методам, доступных для применения в практике. Использованные в настоящее время для диагностики методы трудоемки и длительны [Реакция нейтрализации, электронная микроскопия и иммуноэлектронная микроскопия // Мейхи Б. Вирусология. Методы. - М.:, Мир, 1988. - 344 с], характеризуются недостаточной оперативностью (от 4 до 18 часов) и нестабильностью отдельных компонентов реакции (реакция встречного иммуноэлектрофореза, иммуноферментный анализ, полимерная цепная реакция) [Перадзе Т.В., Халонен П. Иммунологическая диагностика вирусных инфекций. - М.: Медицина. - 1985. - 302 с]. Существующие люминесцентные методы (реакция иммунофлуоресценции и реакция непрямой иммунофлуоресценции) [Фримель Г. Иммунологические методы. М.: Медицина. – 1987. - 472 с.] для своего выполнения требуют наличия коммерческих специфических меченных люминесцентных сывороток, а также отсутствие инструментального учета реакции вносит субъективизм в оценке результатов. Наиболее близким к предлагаемому является способ определения вирусов и антител к ним, предложенный В. А. Мищенко и Е. В. Новожиловой. [Патент №1787272, кл. G 01 N 33/533, опублик. 1993]. Исследуемый материал в количестве 0,3 мл вносят в суспензию культуры перевиваемых клеток в объеме 0,5 мл, добавляют 0,3 мл сыворотки и инкубируют 15-20 минут при 36-38°С, затем в нее добавляют флуоресцентный зонд ДСМ до конечной концентрации 1 мкМ и через 15-20 минут проводят учет результатов по отношению интенсивности флуоресценции в опыте и контроле и при значении показателя равному 1,5 и выше определяют наличие инфекционного агента, а в случае снижения показателя менее 1,5 со специфической сывороткой подтверждают специфичность обнаруженного возбудителя. Определение вируса происходит в течение 40-60 минут. Основным недостатком данного способа является необходимость использования нескольких линий перевиваемых клеток, что не всегда возможно в практических лабораториях. А так же, внесение в суспензию клеток инфекционного материала контаминированного бактериями, обработанного антибиотиками может вызывать неспецифическую деструкцию клеток, ложноположительную флуоресценцию. Постановка реакции in vitro затрудняет проведение скрининговых исследований. В основу изобретения поставлена задача усовершенствовать способ обнаружения вирусов в инфекционном материале от больных и животных путем использования нового вещества в качестве флуоресцентного зонда, что позволяет сократить сроки диагностики вирусных инфекций, отказаться от использования дорогостоящих перевиваемых; клеток и различных коммерческих диагностических сывороток. Обнаружение вирусов в предлагаемом способе, от больных и животных основывается на блокировании специфическим комплексом АГ-АТ клеточной и ядерной мембраны, в результате чего изменяется проницаемость их для флуоресцентного вещества, а также происходит частичное гашение флуоресценции. При репродукции вируса в клетке нарушается трансмембранный потенциал и положительнозаряженный зонд МДХІ накапливается в цитоплазме и, особенно, в ядре. В случае образования комплекса АГАТ при взаимодействии специфической сыворотки состояние мембран клетки и ядра изменяется, проникновение зонда внутрь клетки ограничивается, что и регистрируется по уменьшению интенсивности флуоресценции МДХІ. Поставленная задача решается тем, что в способе определения вирусов, включающем обработку инфекционного материала специфической сывороткой с внесением флуоресцентного зонда, инкубацию и учет результатов, согласно изобретению, подготовленный материал фиксируют на предметном стекле, наносят специфическую сыворотку на 10-15 минут, при +18-20 С, промывают дистиллированной водой, затем обрабатывают флуоресцентным зондом МДХІ в течение 12-15 минут и с помощью фотометрической насадки определяют интенсивность флуоресценции клеток и ядер, а вирусный агент идентифицируют при снижении интенсивности флуоресценции зонда в клетках в 1,5 раза, а в ядрах - в 2 и более раз. Для выбора оптимального объема вносимого зонда изучили зависимость показателя интенсивности флуоресценции от количества флуоресцирующего вещества. В качестве тест-вируса использовали ЦМВ, выделенный от больного ребенка. Зонд МДХІ вносили в количестве 5, 10, 15, 20, 25 и 30 мкл. Результаты исследования представлены в табл.1. Как видим из данных табл. 1 при внесении зонда в количестве от 10 до 20 мкл показатель интенсивности флуоресценции составил диагностически значимую величину от 2,0 до 2,6. А при объеме зонда от 5, 25 и 30 мкл показатель не может быть использован для учета результатов. Вирусный агент определяется непосредственно в инфицированных клетках организма (слизистые, слюна, моча, кровь, СМЖ) фиксированных на предметном стекле. Материал наносят в количестве 20-25 мкл на предметное стекло, фиксируют в 96%-ом этаноле или ацетоне (хч) - 5-10 минут. Затем наносят специфическую сыворотку на 10-15 минут при комнатной температуре (18-20°С), смыкают ее дистиллированной водой, подсушивают и наносят флуоресцентный зонд (МДХІ) в объеме 10-20 мкл. Время экспозиции составляет 12-15 минут при 18-20°С. Учет результатов реакции ведут по отношению интенсивности флуоресценции в опыте и контроле (с нормальной человеческой сывороткой). По снижению интенсивности флуоресценции клеток после взаимодействия со специфической сывороткой в 1,5 раза, а ядер клеток в 2 раза определяют наличие вирусного агента. Способ экспериментально обоснован на референтных штаммах вирусов человека и животных, а также на инфекционном материале, наличие вирусного агента в котором подтверждено известными методами. Были использованы следующие штаммы вирусов: - коронавирус крупного рогатого скота, штамм КЛ-2 (KB); - ротавирус обезьян, штамм SA-11 (РВ); - ротавирус крупного рогатого скота, штамм РМ (РВ); - грипп, тип A (HON1); - вирус простого герпеса, тип 1, штамм Л-2 (ВПГ); - цитомегаловирус, выделенный от больного (ЦМВ); - вирус инфекционного ларинготрахеита, эпизоотический штамм "Г" (ИЛТ). Специфичность поддерживалась с помощью коммерческих сывороток к вирусам: - антигерпетическая, "Биосервис", г. Москва; - гипериммунная к ЦМВ, "NTFRMEDIC", г Москва; - гриппозная диагностическая к HОN1, предприятие по производству бакпрепаратов, г. С.Петербург; - корона, рота-сыворотки, производства ВИЭВ, г. Москва; - сыворотка к вирусу ИЛТ, производства ВНИИБП, г. С.Петербург. Результаты, подтверждающие специфичность предлагаемого способа, представлены в табл. 2. Как видно из представленных в табл. 2 данных при совпадении специфической сыворотки с вирусным агентом интенсивность флуоресценции клетки в случаях КВ, РВ и гриппа уменьшается в 1,72, 1,59 и 1,56 раза соответственно, а в случаях ЦМВ, ВПГ и ИЛТ интенсивность свечения уменьшается в 2,6, 2,01 и 2,0 раз соответственно. Пример 1. Идентификация коронавируса в промывных водах 1. Промывные воды собирают в стерильную посуду, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 минут. Сливают недостаточную жидкость, а осадок ресуспендируют в 1,0 мл физиологического раствора. Подготовленный материал в количестве 20 мкл наносят на обезжиренное стекло, высушивают и фиксируют в 96%-ном этаноле и хч ацетоне в течение 5 минут. Затем наносят 20 мкл антикоронавирусной сыворотки в разведении 1:10 и инкубируют 10 минут при комнатной температуре (18 -20°С). Промывают дистиллированной водой, подсушивают и наносят 10 мкл 10% водного раствора 0,01 М спиртового МДХ1, выдерживают 12 минут. Препараты промывают дистиллированной водой и после этого проводят учет результатов с помощью люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ И-1 с фотометрической насадкой ФМЭЛ-1А под масляной иммерсией. Флуориметрию проводят при длине волны возбуждения 480 нм и эмиссии 580 нм. наблюдается оранжево красное свечение. Среднюю интенсивность флуоресценции (F) клеток рассчитывают по формуле В качестве контроля флуориметрируют инфекционный материал, обработанный нормальной сывороткой человека или крупного рогатого скота, как описано выше. В случае образования специфического комплекса KB АГ-АТ, то есть совпадение антикоронавирусной сыворотки и коронавируса в пробе, интенсивность флуоресценции клетки уменьшается в 1.5 раза по сравнению с контролем (FK/Fon). Например: Пример 2. Идентификация ЦМВ в слюне. Слюну в количестве 2,0 мл центрифугируют 20 мин при 3000 об/мин, надосадок сливают, а осадок ресуспендируют в 7,0 мл физиологическою раствора. Подготовленный материал в количестве 25 мкл наносят на обезжиренное стекло, высушивают и фиксируют в 96%-ном этаноле и хч ацетоне в течение 10 минут. Затем наносят 25 мкл ЦМВ сыворотки в разведении 1:50 и инкубируют 15 минут при комнатной температуре (18-20°С). Промывают дистиллированной водой, подсушивают и наносят 20 мкл 10% водного раствора 0,01 М спиртового МДХ1, выдерживают 15 минут. Препарат промывают дистиллированной водой и после этого проводят учет результатов как описано в примере 1. В качестве контроля флуориметрируют подготовленный препарат слюны, обработанный нормальной сывороткой человека в разведении 1:10, как описано выше. Флуориметрируют как ядра в целых клетках, так и отдельные "вылущенные" ядра в препарате. При нейтрализации ЦВМ-сывороткой вирусного агента происходит уменьшение значения F в 2 раза по отношению к контролю (Fk/Fon) Идентификация ЦВМ в слюне осуществляется в течение 30 минут. Для определения эффективности предлагаемого способа с известным было исследовано 115 образцов различного инфекционного материала от больных (с острой респираторно-вирусной инфекцией, острым гастроэнтероколитом, менингитом, энцефалитом и животных с энтеритами к инфекционным ларинготрахеитом). Результаты представлены в табл. 3. Как видно из данных табл. 3, предлагаемый способ на 100% эффективнее при выявлении вируса гриппа, в 3 раза при ЦМВ. в 1,8 и 1,4 раза при вирусе герпеса и коронавирусе по сравнению с прототипом. Способ испытан для идентификации как ГНК- так и ДНК-содержащих вирусов, относящихся к 7 семействам, Применение предлагаемого способа идентификации вирусов обеспечивает следующие преимущества: 1) сокращение времени диагностики в 2 раза; 2) повышение чувствительности метода за счет использования нового флуоресцентного зонда; 3) отказ от использования дорогостоящих перевиваемых линий клеток; 4) возможность использования различных коммерческих диагностических сывороток; 5) дешевизна.