Спосіб визначення цитокінсекретуючої функції адгерентних нейтрофільних гранулоцитів периферичної крові in vitro

Спосіб визначення цитокінсекретуючої функції адгерентних нейтрофільних гранулоцитів периферичної крові in vitro, що включає виділення чистої популяції нейтрофільних гранулоцитів з периферичної крові, інкубацію та вимірювання вмісту цитокінів в інкубаційному середовищі методом імуноферментного аналізу, який відрізняється тим, що проводять попередню активацію нейтрофільних гранулоцитів периферичної крові шляхом адгезії клітин до скла, а інкубацію проводять протягом 4 годин у поживному середовищі 199. (19) (21) u200701290 (22) 08.02.2007 (24) 25.06.2007 (46) 25.06.2007, Бюл. №9, 2007р. (72) Кадан Людмила Павлівна, Петішкіна Валерія Миколаївна, Підгайна Олена Анатоліївна, Панасюкова Оксана Романівна (73) ІНСТИТУТ ФТИЗІАТРІЇ І ПУЛЬМОНОЛОГІЇ ІМ. Ф.Г. ЯНОВСЬКОГО АКАДЕМІЇ МЕДИЧНИХ Н АУК УКРАЇНИ 3 24278 Відомо, що зрілі нейтрофільні гранулоцити належать до високоспеціалізованих клітин. Вони не здатні ділитися, мають готовий набір біологічно активних речовин, зосереджених в гранула х і при стимуляції відразу ж починають проявляти свої потенційні можливості, реалізуючи їх без особливої морфологічної перебудови. Активовані нейтрофільні гранулоцити секретують поряд із різноманітними ферментами широкий спектр цитокінів, за допомогою яких вони здійснюють імунорегулюючий вплив на інші клітини імунної системи. У диференційованих, короткоживучи х нейтрофільних гранулоцитах (в крові нейтрофільні гранулоцити перебувають 3,5-7 годин) при активації спостерігаються різноманітні події, пов'язані з експресією генів. Визначені зміни в експресії генів, що кодують чисельні транскрипторні фактори та генів, які відповідають за перебудову хроматину та регуляторів синтезу білку. Вказані події відбуваються переважно протягом першої години після активації клітин [див. Gene expression in mature neutrophils: early responses to inflammatory stimuli / Xueqing Zhang, Yuval Kluger, Yasuhiro Nakayama et al. // Journal of Leukocyte Biology. - 2004. - Vol. 75 P.358-372]. В межах 2 годин відбуваються зміни в рівнях декілька сотень мРНК, відповідальних за синтез цитокінів, рецепторів, продуктів, що регулюють апоптоз, та мембранних регуляторів транспорту [див. RNA expression patterns change dramatically in human neutrophils exposed to bacteria / V.B.Yerramilli, K. Subrahmanyam, Shigeru Yamaga et al. // Blood. - 2001. - Vol. 97, N.8. - P.2457-2468]. Відомо, що виділення лейкоцитів з периферичної крові на градієнті щільності призводить до їх активації, про що свідчить посилення експресії молекул адгезії CD 11b та CD16 [див. Watson F, Robinson J.J., Edwards S.W. Neutrophil function in whole blood and after purification: changes in receptor expression, oxidase activity and responsiveness to cytokines // Biosci Rep. - 1992. Vol. 12, N2. - P.123-133]. Також відомо, що адгезія нейтрофілів до ендотеліальних клітин є необхідною умовою для подальшого виконання клітинами своїх функцій і є важливим фактором їх функціональної активації. Ця властивість застосовується при проведенні методик з вивчення різноманітних функцій фагоцитуючи х клітин. Звичайно використовується скляний чи пластиковий не силіконований посуд. При інкубації нейтрофілів на склі (пластику) відбувається адгезія нейтрофільних гранулоцитів до цих матеріалів. Тому ми застосовували цю методику, яка дозволила додатково активувати нейтрофіли після виділення їх на градієнті щільності і, таким чином, отримати матеріал для визначення вмісту цитокінів, що виділили клітини в інкубаційне середовище. Спосіб здійснюють таким чином. 2мл венозної крові нашаровують на градієнт філол-верографіну щільністю 1,090г/см 3. Обережно збирають плазму крові та нашаровують її на філол-верографін щільністю 1,078г/см 3. Протягом 4 30хв. при осаджують клітини у центрифузі при 5°С. Збирають супернатант, відмивають клітини середовищем 199 протягом 10хв. при 1500об./хв., знову збирають супернатант, залишаючи нейтрофільні гранулоцити, що знаходяться на дні пробірки у 1мл поживного середовища 199. Підраховують кількість нейтрофільних гранулоцитів у камері Горяєва, доводять концентрацію клітин до 1млн/мл поживним середовищем 199 та поміщають по 0,25мл клітин в лунку предметного скельця діаметром 1,5см, попередньо нанесеною за допомогою парафільму. Через 15хв. після початку інкубації скла з лункою при 37°С у вологій камері його тричі промивають у забуференому фізіологічному розчині з рН=7,2, звільнюючи від клітин, що не мають здатності до адгезії. Таким чином, отримують моношар адгерентних нейтрофілоцитів. Додають в лунку з клітинами 0,25мл поживного середовища 199 та проводять інкубацію при 37°С у вологій камері протягом 4-х годин. Після її закінчення поживне середовище обережно зливають у центрифужну пробірку, центрифугують при 1000об./хв. 10 хв. для осадження нейтрофілів, які могли залишитися у середовищі і в подальшому впливати на кінцевий результат вимірювання вмісту цитокінів. Збирають супернатант та проводять методику визначення вмісту цитокінів з використанням комерційних тест-систем. Загальний термін дослідження складає 4,5год. Наводимо конкретні приклади здійснення способу. Приклад 1. Донор К. 48 років. Проведено визначення вмісту гама інтерферону ( ІНФg ) та фактору некрозу пухлин альфа ( ФНП a ) за способом, що пропонується. Вміст ІНФg в супернатанті склав 214пкг/мл (за методикою прототипом 180пкг/мл). Вміст ФНП a в супернатанті склав 27,0пкг/мл (за методикою прототипом 26,7пкг/мл), тобто було отримано практично ідентичні результати вимірювання вмісту цитокінів в супернатанті при інкубації клітин протягом 4 годин та 20 годин. Приклад 2. Хворий С, 19 років. Проведено визначення вмісту гама інтерферону ( ІНФg ) та фактору некрозу пухлин альфа ( ФНП a ) за способом, що пропонується. Вміст ІНФg в супернатанті склав 242пкг/мл (за методикою прототипом 210пкг/мл). Вміст ФНП a в супернатанті склав 618пкг/мл (за методикою прототипом 690пкг/мл), тобто було отримано практично ідентичні результати вимірювання вмісту цитокінів в супернатанті при інкубації клітин протягом 4 годин та 20 годин. Всього за способом, що пропонується, обстежено 5 донорів крові та 10 хворих на туберкульоз легень. В Таблиці наведені порівняльні дані вмісту цитокінів в супернатанті, отриманому при інкубації нейтрофільних гранулоцитів протягом 4 та 20 годин у здорових донорів крові та хворих на туберкульоз легень. 5 24278 6 Таблиця Вміст цитокінів у супернатанті, отриманому при інкубації нейтрофільних гранулоцитів протягом 4 та 20 годин у здорових донорів крові та хворих на туберкульоз легень № 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. Обстеження особи Донор З., 21р. Донор К., 48р. Донор П.,52p. Донор П., 33 p. Донор Г., 25p. Хворий Ш.,39p. Хворий С, 21р. Хворий Т., 24p. Хворий М., 38p. Хворий М., 71р. Хворий Е., 56р. Хворий З., 45р. Хворий Ш., 50р. Хворий С, 19р. Хворий Г., 18р. ІНФg пкг/мл 4 год. 20 год. 242 240 214 180 186 184 180 181 188 242 75 30 240 240 244 314 192 210 214 220 220 182 394 214 206 230 242 210 224 224 Середній вміст ІНФg в супернатанті здорових осіб після 4 годинної інкубації склав 202,0±12,9пкг/мл, ФНП a - 21,8±3,9пкг/мл (за методикою прототипом після 20 годин інкубації 207,4±23,7пкг/мл та 23,3±2,8пкг/мл відповідно). У хворих на туберкульоз легень за методикою, що пропонується, рівень ІНФg в супернатанті склав 225,1±25,7пкг/мл, ФНП a - 666,4±111,2пкг/мл (за методикою прототипом після 20 годин інкубації 203,8±26,3пкг/мл та 630,9±102,3пкг/мл відповідно). Таким чином, застосування популяції адгерентних нейтрофільних гранулоцитів дозволяє зна Комп’ютерна в ерстка М. Ломалова 4 год. 21,5 27 32 13 15,7 58 880 648 955 775 590 716 1200 618 224 ФНП a пкг/мл 20 год. 27 26,7 26,7 14 22 184 512 432 1025 1130 752 700 660 690 224 чно зменшити час (з 20,5 до 4,5 годин) дослідження та його вартість (за рахунок використання поживного середовища 199). Даний спосіб може бути застосований у здорових осіб та хворих для оцінки рівня секреції нейтрофільними гранулоцитами цитокінів при різних патологічних процесах, його змін в процесі лікування, вивчення впливу лікарських препаратів в пробах in vitro на інтенсивність синтезу цитокінів з метою з'ясування можливості використання цих препаратів для корекції виявлених порушень. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601