Спосіб визначення апоптозу нейтрофільних гранулоцитів периферичної крові in vitro

Спосіб визначення апоптозу нейтрофільних гранулоцитів периферичної крові in vitro шляхом виділення чистої популяції нейтрофільних гранулоцитів з периферичної крові, їх інкубації, виготовлення цитоспинового препарату на склі, його фарбування та підрахунку відсотку апоптичних клітин, який відрізняється тим, що нейтрофільні гранулоцити периферичної крові інкубують у поживному середовищі 199 на склі протягом 3 годин, а фарбування здійснюють 0,5% водним розчином сафраніну. Корисна модель відноситься до галузі біології та медицини і може бути використана в експериментальних дослідженнях та клінічній практиці для визначення апоптозу нейтрофільних гранулоцитів периферичної крові in vitro у експериментальних тварин, здорових людей та хворих з різною патологією. Найбільш близьким до способу, що пропонується, є спосіб визначення апоптозу нейтрофільних гранулоцитів периферичної крові in vitro (див. Маянский Н.А. Заславская М.И.. Маянский А.Н. Апоптоз экссудативных нейтрофилов человека // Иммунология. -2000. -№2. -С.11-13.), який полягає у тому, що після забору периферичної крові у пацієнта виділяють на подвійному градієнті фіколверографіну чисту популяцію нейтрофільних гранулоцитів, інкубують клітини у силіконованому посуді у повному поживному середовищі, готують цитоспиновий препарат на склі та фарбують його за методом Май-Грюнвальда-РомановськогоГимзи, після чого підраховують відсоток апоптичних клітин. Кількість апоптичних НГ, що визначається за цим методом складає 15,5±2,1%. Але цей метод має ряд недоліків, а саме: - тривалий час проведення дослідження - 2022 години; - потребує застосування повного поживного середовища (середовище DMEM. ембріональної сироватки, антибіотиків) та особливого устаткування, такого як СОг - інкубатор, що обмежують широке застосування цього методу в лікувальних закладах та науково-дослідних установах нашої країни; - недостатню точність дослідження, оскільки фарбування апопотичних НГ за методом МайГрюнвальда-Романовського-Гимзи забезпечує забарвлення як цитоплазми, так і ядерного матеріалу, внаслідок чого у апоптичній клітині, характерною рисою якої є зменшення розмірів за рахунок конденсації цитоплазми та ядерного хроматину, дуже важко роздивитися морфологію клітин; а також зважаючи на те. що в периферичній крові можуть знаходитися і інші клітини у стані апоптозу, наприклад лімфоїдні, а НГ у вигляді окремих апоптичних тілець при фарбуванні за методом Май-Грюнвальда-Романовського-Гимзи мають багато спільних ознак з цими клітинам. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалення способу визначення апоптозу нейтрофільних гранулоцитів периферичної крові in vitro, в якому шляхом інкубації нейтрофільних гранулоцитів периферичної крові у поживному середовищі 199 на склі протягом 3 годин та фарбування нейтрофільних гранулоцитів 0,5% водним розчином сафраніну досягається підвищення точності, скорочення терміну та зменшення вартості дослідження. Поставлене завдання вирішується тим, що у способі визначення апоптозу нейтрофільних гранулоцитів периферичної крові in vitro шляхом виділення чистої популяції нейтрофільних гранулоцитів, їх інкубації, виготовлення цитоспинового со ю 4453 препарату на склі, фарбування його та підрахунку відсотку апоптичних клітин, згідно з винаходом, нейтрофільні гранулоцити периферичної крові інкубують у поживному середовищі 199 на склі протягом 3 годин, а фарбування здійснюють 0,5% водним розчином сафраніну Відомо, ЩО характерними ознаками морфологічних змін апоптуючих нейтрофільних гранулоцитів є конденсація цитоплазми, ущільнення та збереження ЦІЛОСНОСТІ цитоплазматичної мембрани та органел, агрегація, а потім розщеплення хроматину (ДНК), фрагментація клітини з утворенням апоптозних тілець, що містять розщеплену ДНК (пікноз ядра) Морфологічна перебудова супроводжується зниженням функціональної активності клітин Нейтрофільні гранулоцити, що стали на шлях апоптозу, втрачають здатність до поглинання, хемотаксису респіраторному вибуху, секреторної дегрануляци Піддається регресії і плазматична мембрана клітин, відбувається деградація фшаментозного актину, що перешкоджає розпластуванню клітин на субстраті Тому при використанні скляного чи пластикового не силіконованого посуду для проведення методики, відбувається адгезія нейтрофільних гранулоцитів до скла чи пластику, але у процесі інкубації частина клітин, в яких почався процес апоптозу, втрачає адгезивні властивості і переходить до середовища інкубації (не можна виключати і ІНШІ причини втрати адгерентних властивостей клітин) При проведенні стандартної процедури відмивання клітин, ця фракція клітин губиться і обліку підлягають тільки нейтрофільних гранулоцитів, що зберегли адгерентні властивості Ми застосовували технологію, яка запобігає втраті клітин і, таким чином, дозволяє проводити облік апоптозу всіх нейтрофільних гранулоцитів периферичної крові, а саме збереження фракції адгерентних клітин та збирання тих нейтрофільних гранулоцитів, що втратили адгерентні властивості Фарбування апоптичних нейтрофільних гранулоцитів за методом Май-ГрюнвальдаРомановського-Гимзи (який до речи застосовується практично у всіх вітчизняних лабораторіях, де використовуються методи морфологічного обліку апоптозу) забезпечує забарвлення як цитоплазми, так і ядерного матеріалу, внаслідок чого у такій КЛІТИНІ дуже важко розрізнити невеликий шар конденсованої цитоплазми від апоптичних ядер, декілька апоптичних тілець зливаються один з іншим тому що клітини набувають дуже інтенсивного кольору, незважаючи на те, що час фарбування зменшували до мінімального, практично неможливо роздивитися морфологію клітин та визначити наявність конденсованого хроматину У процесі відпрацювання методики з'ясувалося, що цей момент є особливо важливим при обліку тієї популяції нейтрофільних гранулоцитів, яка втрачає адгерентні властивості Нами пропонується окраска препаратів ядерним барвником сафраніном, 0,5% водний розчин якого за 1 хвилину фарбує нейтрофільні гранулоцити, дозволяє отримувати ЯКІСНІ морфологічні препарати, а саме чітко ідентифікувати ядра клітин та оцінити особливості ядерного хроматину Спосіб здійснюють таким чином 2мл венозної крові нашаровують на градієнт фікол-верографіну ЩІЛЬНІСТЮ 1,090Г/СМ 3 Обереж но збирають плазму крові та нашаровують її на 3 фікол-верографін ЩІЛЬНІСТЮ 1,07 г/см Протягом ЗОхв при 1500об/хв осаджують клітини у центрифузі при 5°С Збирають супернатант, залишаючи нейтрофільні гранулоцити, що знаходяться на дні пробірки у 1мл поживного середовища 199 Підраховують КІЛЬКІСТЬ нейтрофільних гранулоцитів у камері Горяєва, доводять концентрацію клітин до 1млн/мл та містять по 0,2мл клітин на предметне скельце з попередньо нанесеною за допомогою парафільму лункою діаметром 1,5см В залежності від того, з якою популяцією нейтрофільних гранулоцитів планує працювати дослідник з адгерентними клітинами чи всією популяцією нейтрофільних гранулоцитів, проводять наступні процедури Якщо планується проводити дослідження з адгерентними клітинами, то через 15 хв після початку інкубації скла з лункою при 37°С у вологій камері, його тричі промивають у забуференому фізіологічному розчині з рН=7,2 звільнюючи від клітин, що не мають здатності до адгезії, і таким чином, отримують моношар адгерентних нейтрофілоцитів Додають у лунку з клітинами 0,2мл поживного середовища 199 та проводять інкубацію Якщо дослідник планує проводити дослідження з всією популяцією нейтрофільних гранулоцитів, то скло з нейтрофільними гранулоцитами інкубують у поживному середовищі 199 при 37°С у вологій камері протягом 3-х годин За цей час деяка КІЛЬКІСТЬ нейтрофільних гранулоцитів піддається апоптозу частина цих клітин втрачає адгерентні властивості та переходить у середовище інкубації Після її закінчення поживне середовище з нейтрофільними гранулоцитами, які втратили адгерентні властивості зливають у центрифужну пробірку, додатково обережно промивають лунку 5-разово середовищем з мікропіпетки, набираючи кожен раз у піпетку 1 мл (загальна КІЛЬКІСТЬ 5мл) Скло з клітинами, що не втратили адгерентних властивостей висушують на повітрі та фіксують метанолом КЛІТИНІ, ЩО були зібрані у пробірку центрифугують при 1000об/хв Юхв, збирають супернатант, залишаючи клітини у невеликій КІЛЬКОСТІ середовища, ресуспендують та готують цитоспиновий препарат Таким чином, навіть при незначному порушенні технології проведення методики (що може бути обумовлено різним ступенем практичних навичок дослідника), неможливо втратити будь яку фракцію клітин для проведення обліку реакції Цитоспиновий препарат також фіксують метанолом і обидва препарати фарбують 1 хвилину 0,5% водним розчином сафраніну Облік проводять за допомогою світлового мікроскопу Розрахунок відсотку апоптичних нейтрофільних гранулоцитів, що піддавалися інкубації протягом 3-х годин, проводять після обліку двох препаратів першого - з фракцією клітин, що зберегли адгерентні властивості протягом інкубації та другого - з тими, що їх втратили Час, що потрібен на підготовку та облік двох препаратів суттєво не впливає на загальний термін дослідження При використанні 0,5% водного розчину саф 4453 раніну протягом 1 хвилини цитоплазма фарбується у блідий червоний колір, на якому чітко видно ядра яскраво-червоного кольору та конденсований хроматин, який фарбується у червоночорний колір При зменшенні розміру клітини цитоплазма набуває більш насиченого кольору, але ядра продовжують чітко контрастуватися на м тлі За рахунок того, що методика проводиться з чистою популяцією нейтрофільних гранулоцитів не виникає проблем з ідентифікацією клітин, незважаючи на те, що цитоплазма фарбується однорідно в різних типах клітин Крім того з'ясувалося, що навіть на тій стадії апоптозу, коли ще не спостерігається пікнозу ядра та зменшення розміру цитоплазми, цей барвник дозволяє чітко бачити конденсацію хроматину у ядрах і, таким чином, дозволяє ідентифікувати більш ранні стадії апоптозу Сафранін має перевагу над іншим ядерним барвником Ми проводили паралельне фарбування клітин іншим широко вживаним ядерним барвником - 0,2% метиловим зеленим Але з'ясувалося, що при такому методі фарбування ядра практично зливаються по кольору з цитоплазмою Наводимо конкретний приклад здійснення способу Донор Ж 27 років Проведено визначення апоптозу нейтрофільних гранулоцитів за спосо Комп'ютерна верстка Н Лисенко бом, що пропонується У препараті, що отримано з фракції клітин, що зберегли адгерентні властивості, КІЛЬКІСТЬ апоптичних НГ склала 9%, серед клітин, що їх втратили - 16,8% Загальна КІЛЬКІСТЬ апопотичних НГ склала 12,9% Всього за способом, що пропонується, обстежено 13 донорів крові Загальна КІЛЬКІСТЬ апоптичних нейтрофільних гранулоцитів в периферичної крові здорових осіб після 3 годинної інкубації клітин склала 15,0±2,6% Даний спосіб може бути застосований у хворих осіб для оцінки апоптозу при різних патологічних процесах, його змін в процесі лікування, вивчення впливу лікарських препаратів, в тому числі і імуномоделюючих, в пробах in vitro на інтенсивність перебігу цього процесу з метою з'ясування можливості використання цих препаратів для корекції порушень апоптозу Таким чином, у зрівнянні із прототипом спосіб, що пропонується дозволяє - підвищити точність обліку апоптозу нейтрофільних гранулоцитів за рахунок фарбування препаратів 0,5% водним розчином сафраніну, що дозволяє чітко розрізняти морфологію ядер клітин, оцінити особливості ядерного хроматину і ідентифікувати більш ранні стадії апоптозу, - значно зменшити час (з 22 до 3,5 годин) дослідження та його вартість (за рахунок використання поживного середовища 199) Підписне Тираж 37 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності вул Урицького 45 м Київ МСП 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності' вул Глазунова 1 м Київ-42 01601