Моноклональні антитіла до igg великої рогатої худоби, придатні для використання у імуноферментних тест-системах

УКРАЇНА (19) UA (11) 26767 (13) U (51) МПК (2006) C12N 5/00 МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ видається під відповідальність власника патенту ДО ПАТЕНТУ НА КОРИСНУ МОДЕЛЬ (54) МОНОКЛОНАЛЬНІ АНТИТІЛА ДО IGG ВЕЛИКОЇ ВИКОРИСТАННЯ У ІМУНОФЕРМЕНТНИХ ТЕСТ-СИСТЕМАХ РОГАТОЇ 1 ХУДОБИ, ПРИДАТНІ ДЛЯ 2 Таблиця 1 4,0 1:1000 87В1 *тестування у непрямому твердофазному ІФА на IgG ВРХ (сорбція 2мкг/мл) Приклад 1. Одержання асцитичної рідини із вмістом моноклональних антитіл 83А3, 87В1 Черевину миші Balb/c обробляли спиртом та внутрішньочеревне вводили по 0,5мл пристану (Sigma, США, кат. номер Т7640) за допомогою стерильного скляного шприца на 1мл або 2мл; використовували стерильні голки «Рекорд» 0,5 х 10-15мм. Мишей витримували 3-4 тижні. Процедуру праймування проводили у гумових рукавичках. Кріопробірки з замороженими клітинами клонів 83АЗ, 87В 1 діставали з судини Дюара із рідким азотом, витримували на повітрі 2-3 хвилини та занурювали у воду із температурою 37-40°С. Пробірки витримували у воді до тих пір, поки повністю розтане лід. Після цього за допомогою піпетки на 1мл суспензії гібридом переносили у пробірки на 15мл (Nunc, кат. номер 366060), повільно додавали 10-15мл середовища DMEM (Sigma, США, кат. номер D 5648) без сироватки. Центрифугували при 1300 об/хв. протягом 3 хв. (13) IgG2b 83А3 U Титр антитіл у культуральній рідині* 1:600 Ізотип 26767 IgG1 Константа афінності, х1010моль/л 5,0 Назва МКАТ (11) Корисна модель стосується імунохімії, гібридомної технології та біотехнології і може бути використаний для одержання моноклональних антитіл (МКАТ) до імуноглобулінів класу IgG великої рогатої худоби (ВРХ) та їхніх імуноферментних кон'югатів. Метою корисної моделі є одержання нових моноклональних антитіл до IgG ВРХ, придатних для використання у імуноферментних тест-системах. Відомі МКАТ до імуноглобулінів класу IgG ВРХ [1]. Проте згадані моноклональні антитіла направлені до підкласів імуноглобулінів класу IgG великої рогатої худоби і непридатні для використання у імуноферментних тест-системах для серологічної діагностики. Найбільш близьким до запропонованих є моноклональні антитіла, які взаємодіють із IgG ВРХ [2]. У порівнянні із вищезгаданим антитілами клони 83А3, 87В1 характеризуються більшою специфічністю та активністю у імуноферментному аналізі. Моноклональні антитіла продукуються гібридними клітинами, що одержані при злитті мієломних мишачих клітин Sp 2/0 та спленоцитів мишей лінії Balb/c. Клони МКАТ 83А3, 87В1 характеризуються наступними ознаками (таблиця 1). імуноферментних тест-системах, належать до класу імуноглобулінів миші, продукуються гібридомами, які одержані внаслідок хімічно індукованої гібридизації імунокомпетентних Влімфоцитів та мієломи Sp 2/0, які отримані за довгостроковою схемою імунізації мишей лінії BALB/c, характеризуються високими константою афінності, титром у культуральній рідині та титром пероксидазного кон’югату. UA (21) u200704445 (22) 23.04.2007 (24) 10.10.2007 (72) НІКОЛАЄНКО ІГОР ВАСИЛЬОВИЧ, UA, ГАЛКІН ОЛЕКСАНДР ЮРІЙОВИЧ, UA (73) НІКОЛАЄНКО ІГОР ВАСИЛЬОВИЧ, UA, ГАЛКІН ОЛЕКСАНДР ЮРІЙОВИЧ, UA (56) (57) Моноклональні антитіла до IgG великої рогатої худоби, придатні для використання у (19) ДЕРЖАВНИЙ ДЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ ОПИС 3 26767 4 Надосад видаляли, а осад клітин ресуспендували Одержаний розчин МКАТ фільтрували через у 10мл середовища DMEM (Sigma, США, кат. фільтри з порами 0,22мкм. номер D 5648) без сироватки. Суспензію Для переведення МКАТ у фосфатний буфер переносили у "пеніциліновий" флакон та використовували 0,02М фосфатний буфер (рН 7,2закривали пробкою. 7,4) та колонку 1,5 х 20см з сефадексом G-25 Суспензію клітин перемішували та набирали у зрівноважену фосфатним буфером. МКАТ, стерильний шприц по 1мл, вводили у черевну одержані раніше, в об'ємі 2-3мл наносили на гель, порожнину мишей (справа або зліва від після поглинання розчину гелем наносили такий серединної лінії на 1 см нижче від реберної дуги), же об'єм буферу. Після поглинання гелем буферу яка за 3-4 тижні до цього була праймована колонку заповнювали фосфатним буфером пристанем. Мишей залишали на 5-10 днів для доверху, вставляли адаптер та проводять елюцію накопичення у черевній порожнині асцитичної фосфатним буфером із швидкістю 2мл/хв. Вихід рідини. піку реєстрували при 280нм. Збирали фракцію Дану процедуру проводили у гумових МКАТ в окремий флакон, додавали 1% 10%-ого рукавичках. азиду натрію та зберігали при плюс 4°С до 6 Через 5-10 днів після введення мишам місяців. суспензій гібридом 83АЗ, 87В 1 у очеревинних Приклад 3. Спосіб одержання кон'югату порожнинах спостерігалося накопичення моноклональних антитіл 83А3, 87В1 з асцитичних рідин. Для її відбору використовували пероксидазою хрону трубку спеціальної голки довжиною 4 см. Голки Кон'югацію МКАТ з пероксидазою хрону стерилізували шляхом обробки етиловим спиртом здійснювали у співвідношенні антитіл до ферменту (70%) протягом 10 хв. Черевину миші обробляли 2:1 (масові долі) методом періодатного окислення спиртом та робили голкою прокол справа або за Tijssen [3] із власними модифікаціями. зліва від серединної лінії на 1 см нижче від При окисленні пероксидазу хрону розчиняли у реберної дуги, відбирали асцитичну рідину у 0,1М бікарбонатному буфері до концентрації пробірку на 15мл (Nunc, кат. номер 366060). Після 15мг/мл та додавали такий же об'єм 14мМ водного відбору рідини місце проколу обробляли розчину періодату натрію. Суміш інкубували спиртовим розчином йоду та на 1 хв. затискали протягом 2 годин при кімнатній температурі. пінцетом. Повторний підбір асцитичної рідини Одержаний таким чином розчин активованої проводили через 2-3 дні. Процедуру підбору пероксидази додавали до розчину антитіл, які асциту проводили доти, доки тварина залишалася попередньо діалізували проти 0,1М карбонатного живою. У середньому одна миша здатна дати 2розчину, рН 9,2. Суміш переносили у герметичну 5мл асциту за один відбір. Асцитичну рідину хроматографічну колонку та додавали 1/3 частину центрифугували у пробірці на 15мл (Nunc, кат. сухого сефадексу G25, інкубували протягом 3 номер 366060) при 5000 об/хв. упродовж 5 хв. годин при кімнатній температурі. Відбирали освітлену фракцію та зберігали у По закінченні інкубації, розчин кон'югату флаконах при мінус 20°С. елюювали з колонки та зупиняли реакцію Процедуру відбору асциту проводили у додаванням 1/20 об'ємні частини водного розчину гумових рукавичках. NaBH4 (5мг/мл), залишаючи на 30хв. при кімнатній Приклад 2. Виділення та очистка температурі. Після цього ще додавали 3/20 моноклональних антитіл 83А3, 87В1 частини розчину боргідриду натрію, інкубували Розморожували асцитичну рідину із вмістом протягом 60хв. Одержаний розчин пероксидазного моноклональних антитіл 83А3, 87В1 та кон'югату МКАТ переводили у 0,02М фосфатний переносили її у центрифужну пробірку на 15мл. буфер з 0,15М NaCI шляхом діалізу. Пробірку поміщали у нагріту до 37°С воду на 10 Приклад 4. Використання кон'югату хвилин. Зважували сульфат натрію в кількості, моноклональних антитіл 83А3, 87В1 з потрібній для 18%-го насичення (вага на об'єм) пероксидазою хрону у тест-системах для асцитичної рідини, всипали у пробірку з асцитом діагностики лейкозу, бруцельозу, туберкульозу та та старанно струшували до розчинення сульфату лептоспірозу у великої рогатої худоби натрію. Спостерігали помутніння, зумовлене У лунки імуносорбенту вносили розчин для випадінням в осад МКАТ. Пробірку розведення сироваток (80мкл) та досліджувані центрифугували при 10000об./хв впродовж 5 сироватки чи молоко ВРХ (20мкл). Планшет хвилин у кутовому роторі. Після чого надосад інкубували при 37°С упродовж 60 хвилин та видаляли, а осад антитіл розводили у 5мл відмивали фосфатно-сольовим буфером з деіонізованої води. Пробірку поміщали у нагріту до детергентом (ФСБД) 4 рази. Далі в лунки вносили 45-50°С воду на 5 хвилин. по 100мкл розчину кон'югату моноклональних Знову зважуювали сульфат натрію у кількості, антитіл (згідно таблиці 2) та інкубували при 37°С потрібній для 16%-го насичення (вага на об'єм) упродовж 30 хвилин. розчину антитіл, всипали у пробірку та старанно струшували до розчинення сульфату натрію. Таблиця 2 Спостерігали помутніння, зумовлене випадінням антитіл в осад. Пробірку центрифугували при МКАТ у 10000 об./хв впродовж 5 хвилин у кутовому роторі. Призначення тест-системи складі Після чого надосад видаляли, а осад антитіл кон'югату розводили у 2-3мл деіонізованої води. 5 Виявлення антитіл до Brucella abortus у сироватці крові великої рогатої худоби Виявлення антитіл до Brucella abortus у молоці корів Виявлення антитіл до Mycobacterium bovis у сироватці крові великої рогатої худоби Виявлення антитіл до Leptospira у сироватці крові interrogans великої рогатої худоби Виявлення антитіл до вірусу лейкозу великої рогатої худоби 26767 87В1 83А3 Далі в лунки вносили по 100мкл розчину хромогену - 3,3', 5,5'-тетраметилбензидину - й інкубували при 18-25°С в темному місті протягом 30 хвилин, після чого реакцію зупиняли внесенням у всі лунки по 100мкл стоп-реагенту. Через 5 хвилин після зупинення реакції визначали оптичну густину при 450нм/620нм. Джерела інформації: 1. Saegermana С., De Waeleb L., Gilsonb D. et al. Evaluation of three semm i-ELISAs using monoclonal antibodies and protein G as peroxidase conjugate for the diagnosis of bovine brucellosis // Veterinary Microbiology. - 2004. - Vol. 100, 1-2. -P. 91-105. 2. Kittelbergera R., Reichela M., Meynella R. et al. Detection of antibodies against the core protein p24 of the bovine leukaemia virus in cattle for confirmatory serological testing // Journal of Virological Methods. - 1999. - Vol. 77, 1. - P. 109 114. 3. Tijssen P. Preparation of enzyme-antibody or enzyme-macromolecule conjugates // Laboratory techiques in biochemistry and molecular biology: practice and theory of enzyme immunoassays / Editors R.H. Burdon, P.H. van Knippenberg. Amsterdam: Elsevier, 1985. - P. 221-241. 6