Спосіб визначення біологічної активності лектинів

Спосіб визначення біологічної активності лектинів, що включає реакцію гальмування гемаглютинації речовинами-інгібіторами з подальшою бальною оцінкою, який відрізняється тим, що як речовини-iнгібітори використовують фенольні сполуки. (19) (21) u200704874 (22) 03.05.2007 (24) 26.11.2007 (72) ПОСПЄЛОВ СЕРГІЙ ВІКТОРОВИЧ, UA (73) ПОЛТАВСЬКА ДЕРЖАВНА АГРАРНА АКАДЕМІЯ, UA (56) 3 27929 4 Підрахунок активності реакції гемаглютинації Нами експериментально було доведено, що проводили за бальною оцінкою, описаною вище. окрема фенольна сполука здатна по різному Результати аналізу свідчать (Таблиця 1), що інгибірувати гемаглютинуючу активність різних серед лектинів, що оцінювались, високою лектинів, тобто має місце нова властивість біологічною активністю по відношенню до лектинів - специфічна взаємодія по відношенню до пірокатехину характеризується лектин картоплі фенольних сполук. (12,5 балів). Інші лектини проявляли не високу Спосіб здійснюється наступним чином. активність до пірокатехину - від 1,0 до 4,0 балів. Фіксовані об'єми препарату лектину з постійним титром (1:4) поміщають в імунологічні планшети і змішують з рівними об'ємами фенольної сполуки, що досліджується, у серії послідовного двократного розведення. Систему Оцінка біологічної активності фітолектинів по віднош інкубують одну годину при кімнатній температурі, після чого в кожну лунку додають тотожній об'єм Активність реакції гемаглютинації (в балах 2%-ної суспензії тричі відмитих еритроцитів і Фітолектини без речовини при взаємодії з пірокатехіно залишають на 1-2 години при температурі +25°С. інгібітору активність) Аналогічно проводять постановку реакції 1. Картопля 23,0 10,5 гемаглютинації з лектином, що досліджується, без 2. Горох 20,0 18,5 додавання фенольної сполуки. 3. Вика 24,0 21,0 Оцінку гемаглютинуючої здатності лектинів, як 4. Сочевиця 23,0 19,0 при взаємодії з фенольними сполуками, так і без 5. Квасоля 24,0 23,0 них, проводять візуально за п'ятибальною (ФГА) шкалою: 3 бали - різко виражена аглютинація. Приклад 2. Необхідно визначити біологічну Еритроцити у вигляді тонкої плівки рівномірно активність лектинів картоплі, гороху, вики, розподіляються по всьому дну лунки; сочевиці та квасолі по відношенню до фенольної 2 бали - помірна аглютинація. Еритроцити сполуки пірогалолу. розходяться по дну лунки на відстані, яка Для цього використовували хімічно чисті перевищує в діаметрі 2мм, утворюючи кільце із сполуки вказаних речовин. Розчини лектинів з різко виявленою зернистістю по краях; титром аглютинації 1:4 на протязі однієї години 1 бал - слабка аглютинація. Еритроцити інкубували з розчином пірогалолу, після чого в розходяться по донцю лунки на відстані менш 2-х систему додавали 2%-ну суспензію тричі відмитих мм, утворюючи кільце або диск; еритроцитів людини і через дві години проводили 0,5 бала - мінімальна аглютинація. В центрі реєстрацію даних. Паралельно оцінювали скупчення еритроцитів, що осідають на дно лунки, гемаглютинуючу активність чистих лектинів. утворюється невеличкий отвір; Підрахунок активності реакції гемаглютинації 0 балів - відсутність аглютинації. Еритроцити проводили за бальною оцінкою, описаною вище. скупчуються у центрі лунки. Результати аналізу свідчать (Таблиця 2), що Перш за все визначають інтенсивність по відношенню до пірогалолу всі лектини, що аглютинації розчину лектину без додавання оцінювались, мали не високу біологічну активність фенольної сполуки - інгібітору. При цьому додають - від 0,0 до 6,0 балів. значення в балах кожної лунки імунологічного планшету. У випадку, коли проба аналізується у восьми лунках, ця величина в залежності від активності препарату, може досягати 24 балів. Оцінка біологічної активності фітолектинів по віднош Далі обчислюють суму балів реакції гемаглютинації суміші лектин-фенольна сполука Активність реакції гемаглютинації (в балах) (дійсна активність). Вона встановлюється при додаванні до лектину фенольної сполуки у восьми Фітолектини послідовних розведеннях. при взаємодії з Після цього обчислюють різницю сум балів між без речовини - інгібітору пірокатехіном пробами, що є показником специфічності лектину. (дійсна активність Чим більше різниця, тим вища біологічна 6. Картопля 23,0 17,0 активність лектину до фенольної сполуки. 7. Горох 20,0 20,0 Приклад 1. Необхідно визначити біологічну 8. Вика 24,0 21,0 активність лектинів картоплі, гороху, вики, 9. Сочевиця 23,0 21,0 сочевиці та квасолі по відношенню до фенольної 10. Квасоля (ФГА) 24,0 23,0 сполуки пірокатехину. Для цього використовували хімічно чисті Приклад 3. Необхідно визначити біологічну сполуки вказаних речовин. Розчини лектинів з активність лектинів картоплі, гороху, вики, титром аглютинації 1:4 на протязі однієї години сочевиці та квасолі по відношенню до фенольної інкубували з розчином пірокатехину, після чого в сполуки саліцилової кислоти. систему додавали 2%-ну суспензію тричі відмитих Для цього використовували хімічно чисті еритроцитів людини і через дві години проводили сполуки вказаних речовин. Розчини лектинів з реєстрацію даних. Паралельно оцінювали титром аглютинації 1:4 на протязі однієї години гемаглютинуючу активність чистих лектинів. 5 27929 інкубували з розчином саліцилової кислоти, після чого в систему додавали 2%-ну суспензію тричі відмитих еритроцитів людини і через дві години проводили реєстрацію даних. Паралельно оцінювали гемаглютинуючу активність чистих лектинів. Підрахунок активності реакції гемаглютинації проводили за бальною оцінкою, описаною вище. Результати аналізу свідчать (Таблиця 3), що по відношенню до саліцилової кислоти всі лектини, що оцінювались, мали досить високу біологічну активність - від 8,0 до 14,0 балів. Але найбільш високою специфічністю характеризувались лектини вики та сочевиці (14,0 балів). 6 Таблиця 3 Оцінка біологічної активності фітолектинів по відношенню до саліцилової кислоти Активність реакції гемаглютинації (в балах) Фітолектини 11. Картопля 12. Горох 13. Вика 14. Сочевиця 15. Квасоля (ФГА) при взаємодії з пірокатехіном (дійсна активність) Біологічна активність (в балах) без речовини - інгібітору 21,5 12,5 23,0 20,5 21,5 10,0 4,5 9,0 6,5 11,0 11,5 8,0 14,0 14,0 10,5