Склад реактивної суміші для діагностики резистентності до ізоніазиду збудника туберкульозу

Склад реакційної суміші для діагностики резистентності до ізоніазиду збудника туберкульозу, який містить хлорид магнію, суміш деоксинуклеотидів трифосфа тів, праймер katgОF, праймер katg5R, праймер katg4R, рекомбінантну Taq ДНК полімеразу і зразок ДНК, що досліджується, який відрізняється тим, що додатково містить компоненти - буфер для полімеразно-ланцюгової реакції червоний та воду для полімеразно-ланцюгової реакції при наступному співвідношенні, мас. %: ПЛР буфер червоний 10 мкл або 40,0 % 2 мкл (вміст 50 хлорид магнію мілімоль/мкл) або 8,0 % суміш 2,5 мкл (вміст – 200 деоксинуклеотидів мікромоль/мкл кожного) або трифосфаті в 10,0 % 0,67 мкл (вміст – 45 праймер katg0F пікамоль/мкл) або 2,7 % 0,57 мкл (вміст – 53 праймер katg5R пікамоль/мкл) або 2,3 % 0,82 мкл (вміст – 49 праймер katg4R пікамоль/мкл) або 3,3 % рекомбінантна Taq0,8 мкл (вміст – 5000 ДНК полімераза Од/мл) або 3,2 % Корисна модель відноситься до медицини та біології і може бути застосована для визначення медикаментозної резистентності збудника туберкульозу. Як відомо, туберкульоз є найпоширенішою інфекційною хворобою. Одним з головних факторів, що сприяє зростанню захворюваності на туберкульоз, є швидке поширення штамів мікобактерій, що є резистентними до протитуберкульозних препаратів [1]. Це обумовлює важливість удосконалення діагностики медикаментозної резистентності збудника туберкульозу. Найбільш близьким до запропонованого складу є суміш, за Мокроусовим І. [2], яка складається з: очищеного зразка ДНК 0.1мкл 0.67мкл (вміст праймеру katg0F 45пікамоль/мкл) праймеру katg5R 0.57мкл (вміст 53пікамоль/мкл) 0.82мкл (вміст праймеру katg4R 49пікамоль/мкл) 1.0мкл (вміст хлориду магнію 50мілімоль/мкл) рекомбінантної Taq 0.2мкл (при вмісті ДНК полімерази 5000Од/мл) суміші 2.5мкл (вміст деоксинуіклеотидів 200мікромоль/мкл трифосфаті в кожного) Однак, використання зазначеної методики є малоінформативним через недостатню якість зображення, яка обумовлена сумішшю прототипу. В основу корисної моделі поставлено задачу розробки складу реакційної суміші для діагностики резистентності до ізоніазиду збудника туберкульозу за рахунок введення додаткових компонентів, а саме буферу для полімеразноланцюгової реакції червоний та води для полімеразно-ланцюгової реакції, що має покращити якість зображення та точність U (13) 29211 (11) решта до 25 мкл або до 100,0 %. UA вода для ПЛР що 1,14 мкл або 4,6 % (19) зразок ДНК, досліджується 3 29211 діагностики медикаментозної резистентності М. tuberculosis, в тому числі за рахунок збільшення вмісту хлориду магнію та рекомбінантної Taq ДНК полімерази до 2мкл та 0.8мкл - відповідно. Поставлена задача вирішується тим, що, згідно корисної моделі, додатково до хлориду магнію, суміші деоксинуклеотидів трифосфатів, праймерів katG OF, 5R та 4R, рекомбінантної Taq ДНК полімерази і зразка ДНК, що досліджується, запропонований склад містить буфер для полімеразно-ланцюгової реакції червоний - 10мкл та воду для полімеразно-ланцюгової реакції решта до 25мкл. Склад реакційної суміші одержаний наступним чином. Склад реакційної суміші для діагностики резистентності до ізоніазиду збудника туберкульозу, який містить, хлорид магнію, суміш деоксинуклеотидів трифосфатів, праймер katG OF, праймер katG 5R, праймер katG 4R, рекомбінантну Taq ДНК полімеразу і зразок ДНК, що досліджується, а також він додатково має компоненти - буфер для полімеразно-ланцюгової реакції червоний та воду для полімеразноланцюгової реакції в наступних співвідношеннях, мас.%: ПЛР буфер червоний 10мкл або 40.0% 2мкл (вміст хлорид магнію 50мілімоль/мкл) або 8.0% суміш 2.5мкл (вміст деоксинуклеотидів 200мікромоль/мкл кожного) трифосфаті в або 10.0% 0.67мкл (вміст праймер katg0F 45пікамоль/мкл) або 2.7% 0.57мкл (вміст праймер katg5R 53пікамоль/мкл) або 2.3% 0.82мкл (вміст праймер katg4R 49пікамоль/мкл) або 3.3% рекомбінантна Taq 0.8мкл (вміст - 5000Од/мл) ДНК полімераза або 3.2% зразок ДНК, що досліджується 1.14мкл або 4.6% решта - вода для ПЛР до 25мкл або до 100.0% Загальний об'єм суміші - 25мкл або 100%. Введення до складу такого компоненту як буферу для полімеразно-ланцюгової реакції червоного забезпечує стабільність реакції завдяки наявності в ньому оптимального вмісту іонів та рівня рН. Це забезпечує найкращі умови для роботи праймерів та ампліфікації потрібних фрагментів. Додавання до складу води для полімеразноланцюгової реакції або деіонізованої води доводить об'єм до стандартного 25мкл і забезпечує необхідне для компонентів складу розведення. Збільшення, відносно прототипу, вмісту хлориду магнію та рекомбінантної Taq ДНК полімерази збільшує е фективність реакції, пришвидшує її та робить результати реакції більш наочними. На Фіг. зображено результати електрофорезу за умов використання запропонованого складу. 4 Літерами А та В позначено маркери молекулярної ваги, які дозволяють визначити молекулярну вагу фрагментів, що ампліфікуються. Номерами від 1 та 2 позначено негативний контроль, тобто проби, куди ДНК не додавалось і ампліфікація не мала відбутись, як видно що ми і бачимо на зображенні. Номерами від 3 до 16 позначено зразки, де відбулась ампліфікація. На доріжках 3, 7, 8, 15, 16 ампліфікувався фрагмент, що, згідно маркерів молекулярної ваги, складається з 292 пар нуклеотидів (позначення S). Це значить, що зразки збудника туберкульозу, які досліджувались у цих доріжках, не мають мутації у кодоні 315 гену katG, тобто вони є чутливими до дії ізоніазиду. В той же час на доріжках 4-6, 9-14 ампліфікувався фрагмент, що, згідно маркерів молекулярної ваги складається з 435 пар нуклеотидів (позначення R). Це означає, що зразки збудника туберкульозу, які досліджувались у ци х доріжках, мають мутації у кодоні 315 гену katG, тобто вони є нечутливими до дії ізоніазиду. Серед 102 отриманих ДНК-ізолятів культур збудника туберкульозу мутація у кодоні 315 гена katG була виявлена в 56 ізолятах (54.9%), відповідно мутація була відсутня в 46 ізолятах (45.1%). Серед 56 ізолятів, що мали мутацію кодона 315 гена katG, 47 (83.9%) були резистентними, згідно з даними культурального методу, водночас 9 (16.1%) були чутливими до дії ізоніазиду. Далі, серед 46 ізолятів, що не мали мутації, 39 (84.8%) культур були чутливими до дії ізоніазиду, а 7 (15.2%) - були резистентними. При дослідженні внеску даної мутації до формування нечутливості до ізоніазиду було встановлено, що він був близько 87.0%. Запропонований склад реакційної суміші для діагностики резистентності до ізоніазиду за рахунок введення додаткових компонентів буферу для полімеразно-ланцюгової реакції червоний та води для полімеразно-ланцюгової реакції, а також збільшення вмісту хлориду магнію та рекомбінантної Taq ДНК полімерази, покращує якість зображення та точність діагностики медикаментозної резистентності M.tuberculosis і робить цей метод діагностики більш наочним. Література 1. О.А. Ткач Чутли вість мікобактерій туберкульозу до сучасних антимікобактеріальних препаратів у хворих на деструктивний туберкульоз легень // Український пульмонологічний журнал. 2004. - №4. - С.38-41. 2. Mokrousov I., Otten Т., Filipenko M., Vya zova ya A. and all. Detection of Izoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by a multiplex allele-specific PCR assay targeting katG codon 315 variation // J Clin Microbiol. - 2002. - Vol.40, №7. p.2509-2512. 5 29211 6