Спосіб мікроклонального розмноження регенерантів хмелю, вирощених з апексів in vitro

1. Спосіб мікроклонального розмноження регенерантів хмелю, вирощених з апексів in vitro, при якому в стерильних умовах один регенерант хмелю ділять на мікроживці за кількістю міжвузлів, укорочують довжину листови х пластинок, формують поживне середовище з мікроелементами за прописом Мурасига й Скуга, макроелементами, вітамінами у вигляді тіамінуНС, піридоксину-НС і мезоінозиту, джерелом вуглеводів, фітогормонів у вигляді bіндолілоцтової кислоти, агар-агару, який відрізняє ться тим, що мікроживці виконують розмірами 10-20 мм із довжиною листових пластинок - 0,5-1,0 довжини мікроживця, поживне середовище формують з макроелементами за прописом Нича й Нич, при цьому до вітамінів додають фолієву кислоту в кількості - 1-5 мг/л, а тіамін-НС використовують у кількості - 1-5 мг/л, U 2 (19) 1 3 30753 фракцією 3-5мм [див. деклараційний патент України на винахід №59131А, МПК А01Н 4/00, 2003 p.]. Однак при такому способі розмноження рослин хмелю можливе утворення калюсної тканини, що підвищує ризик виникнення мутацій та генетичної нестабільності у рослин, що негативно впливає на сортову стабільність матеріалу, що розмножується. Крім того при використанні цього методу регенерація мікросаджанця досягається у два етапи, що ускладнює процес одержання садивного матеріалу, при цьому забезпечується розмноження тільки ароматичних сортів хмелю. Завданням по створенню способу мікроклонального розмноження регенерантів хмелю, вирощених із апексів in vitro, що заявляється, є виключення можливості утворення калюсної тканини у рослин, що забезпечить сортову стабільність матеріалу, який розмножується. Поставлене завдання вирішується тим, що при здійсненні способу мікроклонального розмноження регенерантів хмелю, вирощених з апексів in vitro, при якому в стерильних умовах один регенерант хмелю ділять на мікроживці за кількістю міжвузлів, укорочують довжину листови х пластинок, формують поживне середовище з мікроелементами за прописом Мурасига й Скуга, макроелементами, вітамінами у вигляді тіамінуНС, пірідоксину-НС і мезо-інозиту, джерелом bвуглеводів, фітогармонів у вигляді індолілоцетової кислоти, агар-агару, відповідно до корисної моделі мікроживці виконують розмірами 10-20мм із довжиною листових пластівок - 0,5-1,0 довжини мікроживця, поживне середовище формують із макроелементами за прописом Нича й Нич, при цьому до вітамінів додають фолієву кислоту в кількості - 1-5 мг/л, а тіамін-НС виконують у кількості - 1-5мг/л, пірідоксин-НС - 15мг/л, мезо-інозит - 80-120мг/л, крім того в якості джерела вуглеводів застосовують глюкозу в кількості - 20-40г/л, причому в якості фітогармонів додатково застосовують кінетин у кількості 0,050,5мг/л, а b -індолілоцетову кислоту - 6-15мг/л, при цьому мікроживці вирощують на поживному середовищі при температурі +23-27°С, освітленості 1,5-3 кілолюкс, при 14-17 годинному світлоперіоді до формування вкоріненого мікросаджанця, далі процес повторюють до одержання необхідної кількості мікросаджанців, причому останні висаджують у суміш торф-пісок у співвідношенні 3:1-3:2 з РН - 5,5-6,5, вологістю 4070%, попередньо видаливши залишки поживного середовища із кореневої системи й провівши обробку останньої у фунгіциді. Крім того, вітаміни можуть бути виконані в кількості: - фолієва кислота - 2мг/л, - тіамін-НС - 2мг/л, - пірідоксин-НС - 2мг/л, - мезо-інозит - 100мг/л, а глюкоза в кількості - 30г/л, b -індолілоцетова кислота - 10мг/л, кінетин - 0,1мг/л. 4 Застосування пропонованого способу мікроклонального розмноження регенерантів хмелю, вирощених з апексів in vitro, дозволяє забезпечити наступний технічний результат: виключається можливість утворення калюсної тканини у рослин; - зменшується собівартість вирощування одного саджанця за рахунок скорочення технологічних операцій і витрат. Крім того: забезпечується сортова стабільність матеріалу, що розмножується; покращуються економічні показники підприємства, що займається розмноженням регенерантів хмелю за рахунок скорочення технологічного процесу; забезпечується розмноження як ароматичних, так і гірких сортів хмелю. Регенеранти хмелю, вирощені з апікальних меристем in vitro, переносять у бокс і живцюють у стерильних умовах за кількістю міжвузлів. З одного регенеранту вирізують 5-8 мікроживців з парою листочків і пазушних бруньок. Живці укорочують до розмірів 15±5мм, якщо листова пластинка має розмір більше живця, тоді її обрізають на 1/2-2/3 площі. Нарізані мікроживці за допомогою стерильних пінцетів висаджують на штучне стерильне агаризоване поживне середовище. Регенерацію й клонування мікроживців хмелю проводятьна поживному середовищі, в склад якого входять макроелементи за прописом Нича й Нич і мікроелементи за Мурасига й Скуга. Крім мінеральних складових до складу середовища вводять вітаміни: тіамін-НС 1-4мг/л, пірідоксин-НС - 1-4мг/л, фолієва кислота 1-4мг/л, мезо-інозит - 100±20мг/л, а також глюкоза - 30±10г/л, агар-агар - 4,0±0,5г/л і фітогормони: bкінетин у концентрації 0,05-0,5мг/л і індолілоцетову кислоту у концентрації 10,0±4,0мг/л. Вирощують при температурі +2427°С, освітленості 2-3 кілолюкс, при 16-годинному світловому періоді протягом 30-40 діб, а потім операцію повторюють до одержання необхідної кількості регенерантів. Для одержання мікросаджанців, придатних для висаджування в ґрунт, готовлять торфосуміш, змішуючи тор ф і пісок у співвідношенні 3:1. Вологість суміші повинна бути в межах 40-70%, РН - 5,0-6,5. Після одержання потрібної кількості регенерантів останні відмивають водою від агару й висаджують у посудини, заповнені торфосумішшю, поміщають у к ультуральную кімнату. Акліматизацію проводять при температурі - +2227°С, відносної вологості повітря 70-95%, освітленості 2-3 кілолюкс і довжині світлоперіода 16 годин. У таких умовах рослини витримують протягом двох тижнів після чого переносять у теплицю для дорощування. Результати досліджень впливу вмісту компонентів поживного середовища на розвиток мікроживців хмелю зведені в таблицю. 5 № з/п. Параметри 1 Фолієва кислота 2 Тіамін-НС 3 Пірідоксин-НС 4 Мезо-інозит 5 Глюкоза 6 Індолілоцетова кислота 7 Кінетин 30753 Мінімальна концентрація 1мг/л - знижується інтенсивність розвитку 1мг/л - знижується інтенсивність розвитку 1мг/л - знижується інтенсивність розвитку Оптимальна концентрація 2мг/л інтенсивність розвитку оптимальна 2мг/л інтенсивність розвитку оптимальна 2мг/л інтенсивність розвитку оптимальна 80мг/л - утворення 100 мг/л - утворення коріння знижується на коріння спостерігається у 20% 99% мікроживців 20г/л утворення недостатній, гальмується пагонів 6 мг/л утворення недостатній процес 30г/л - забезпечується коріння оптимальний процес утворення коріння та ріст ріст пагонів процес 10мг/л - забезпечується коріння 100% утворення коріння 0,05мг/л - інтенсивність 0,1мг/л - забезпечується розвитку недостатня 100 %утворення коріння 6 Максимальна концентрація 5мг/л - уповільнюється ріст 5мг/л - уповільнюється ріст 5мг/л - уповільнюється ріст 120мг/л утворення коріння спостерігається у 99% мікроживців, але зростають витрати 40г/л - забезпечується оптимальний процес утворення коріння та ріст пагонів, но зростають витрати 15мг/л - гальмується ріст пагонів, знижується інтенсивність розвитку. 0,5мг/л -затримується процес утворення коріння