Спосіб виявлення рнк вірусу діареї великої рогатої худоби

Спосіб виявлення РНК вірусу діареї ВРХ, що включає екстракцію РНК, її зворотну транскрипцію та ампліфікацію кДНК вірусу ВД, який відрізняється тим, що використовують праймери BVDV_F (5' AGG CGA GCC ATG ССС ТTА GT 3') та BVDV_R (5' ТСТ GCA GCA CCC TAT CAG G З'), які фланкують ділянку UTR 5' за температури відпалу 56 °С і синтезують фрагмент довжиною 244 п.н. (19) (21) u200712241 (22) 05.11.2007 (24) 25.03.2008 (46) 25.03.2008, Бюл.№ 6, 2008 рік (72) ГЕРІЛОВИЧ АНТОН ПАВЛОВИЧ, UA, СТЕГНІЙ БОРИС ТИМОФІЙОВИЧ, UA, ЛИМАНСЬКА ОЛЬГА ЮРІЇВНА, UA, СТЕГНІЙ МАРИНА ЮРІЇВНА, UA (73) ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ, UA 3 оболонок від інфікованих тварин, проби фекалій, сперму ВРХ, культуральні розплодки вірусу та зразки клітинних культур і готових ветеринарних імунобіологічних препаратів при контролі щодо контамінації вірусом діареї ВРХ. Екстракція загальної РНК проводиться за допомогою набору для екстракції Рибосорб (Амплисенс, Москва, Росія), або аналогічного. Процедура складається із лізису клітин та їх детриту, сорбції РНК на сорбенті, дво-триразового відмивання сорбованої РНК та екстракції РНК із сорбенту за допомогою DEPS-води. Зворотна транскрипція сумарної РНК проводиться за допомогою набору Реверта-L (Амплисенс, Москва, Росія), або аналогічного. Продукт зворотної транскрипції кДНК застосовують як досліджувану пробу в реакції ампліфікації. Ампліфікація. Готують загальну (для усієї кількості проб) суміш реагентів для ампліфікації з розрахунку (на 1 пробу): деіонізованої води 12,5мкл 50мМ Mg++ 2,5мкл реакційного буферу 5,0мкл суміші dNTP 2,5мкл праймерів по 1мкл Taq-полімерази 0,5мкл. Після додавання Taq-полімерази, що проводиться в останню чергу, одержану суміш ретельно перемішують на вортексі. Після чого,суміш у дозі 25мкл вносять в усі пробірки підготовлені для ампліфікації. Потім додають в усі пробірки по 1 краплі (близько 25мкл) мінерального масла. Для проведення ампліфікації у відповідну пробірку з реакційною сумішшю під шар масла вносять 5мкл розчину сумарної кДНК проби. Для негативного контрольного зразку в пробірку вносять - 5мкл деіонізованої води, а в пробірку для позитивного контрольного зразку - 5мкл розчину кДНК з інактивованої формаліном розплодки вірусу діареї. Пробірки закривають й центрифугують протягом 3-5 секунд при 2000об/хв на мікроцентрифузі. Переносять пробірки в нагрітий до температури 95°С програмний термостат (ампліфікатор) і проводять ампліфікацію за наступною програмою (табл.). Після закінчення реакції проводять аналіз продуктів ПЛР, шляхом поділу фрагментів ампліфікованої кДНК у агарозному гелі. Потім проводять електрофоретичний аналіз продуктів ПЛР. Приготування робочого розчину буфера (ТБЕ) для електрофорезу. У мірну колбу ємністю 1000,0см3 вносять вміст пакета з буфером для електрофорезу, доводять до мітки дистильованою водою та ретельно перемішують до повного розчинення осаду. Приготування агарозного гелю. У конічну колбу ємністю 250см3 вносять вміст одного пакета з агарозою, додають 100,0см3 робочого розчину буфера ТБЕ і ставлять колбу на водяну баню. Вміст колби доводять до кипіння, повністю розтоплюють, помішуючи скляною палочкою та охолоджують до температури 50 31039 4 60°С. Отриманий розчин агарози повинен бути прозорим і не вміщувати окремих нерозчинених часток. Після чого у колбу з розчином агарози вносять 50,0мкл розчину броміду етидія. Підготовка електрофоретичної камери до заливання агарозного гелю. Встановлюють гребінку на платформу, розміщуючи її на відстані 3см одна від одної та заливають у неї охолоджену до температури 50°С агарозу . Після застигання агарози (приблизно через 25-30хв.) обережно витягають гребінку; платформу з агарозним гелем переносять до електрофоретичної камери. В електрофоретичну камеру заливають необхідну кількість розчину буфера ТБЕ так, щоб він покривав агарозний гель шаром завтовшки 45мм.. Для нанесення проби відбирають у кількості 10мкл продукту ампліфікації та вносять у відповідну лунку агарозного гелю, під шар буфера ТБЕ так, щоб вміст одного кармана агарозного гелю не перетікав у інший. Електрофорез проводять у градієнті напруги 8В/см. Потім виймають платформу з агарозним гелем з електрофоретичної камери, дають рідині стекти з гелю та промивають агарозний гель дистильованою водою у кількості 200см3 2-3 рази. Агарозний гель вміщують на скло УФтрансілюминатору. Фрагменти аналізованої ДНК виявляються у вигляді смужок жовтогарячого кольору при проходженні УФ-випромінювання з довжиною хвилі 310нм. Облік результатів. У негативному контрольному зразку (К-) смужки відсутні. Поява смужки на рівні позитивного контролю свідчить про контамінацію (забруднення) компонентів набору. У позитивних контрольних зразках (К+) одна смужка жовтогарячого кольору розміром 244 нуклеотидний залишок (н.з.). Відсутність смужки жовтогарячого кольору на рівні позитивного контролю (К+) (244н.з.) свідчить про відсутність вірусу діареї ВРХ. Наявність смужки, що відповідає за електрофоретичною рухливістю позитивному контролю (244п.н.), свідчить про присутність вірусу. Результат аналізу не можна вважати достовірним, якщо на доріжці будь-якого негативного контролю виявляється специфічна смужка. Необхідно поставити не менше трьох негативних контролів на етапі виділення ДНК і стільки ж на етапі постановки ПЛР для виявлення джерела контамінації. Ефективність способу розкривається в прикладах. Приклад 1 З метою визначення специфічності, чутливості та точності розробленого способу була використана панель з 12 РІФ-позитивних та 12 РІФ-негативних щодо вірусу діареї проб. У результаті ампліфікації РНК ВД ВРХ була виявлена в 12 РІФ-позитивних та 2 РІФ-негативних щодо вірусу діареї зразках, що свідчить про вищу чутливість способу за РІФ. Дослідження були проведені дворазово, при повтореннях результати відтворені. Приклад 2 5 31039 Для визначення внутрішньовидової специфічності способу було використано зразки РНК вірусу класичної чуми свиней та клітинну РНК ВРХ. Після ампліфікації встановлено відсутність смуг в усіх гетеро логічних контролях. Специфічні продукти реакції утворювались лише з пробами РНК з матеріалу від інфікованих тварин. Приклад 3 Були досліджені зразки 12 ліній та субліній культур перещеплюваних клітин (РК-15, MDBK, MDCK, ВНК-21, FLK, SPEV, Vero, РО-2, СТ, CEF). РНК ВД виявлено в одному зразку. Пізніше вірус ідентифікували за ПЛР з праймерами комерційної тест-системи для виявлення ВД ВРХ методом ПЛР (НВО «Нарвак», Російська Федерація). Розроблений спосіб виявлення ДНК вірусу інфекційного ларинготрахеїту за допомогою ПЛР, має більш виражену специфічність, вищу собівартість і може успішно використовуватись у практиці лабораторних досліджень. Таблиця № циклу 1 2 3 Температура Час 95°С 95°С 56°С 72°С 72°С 2хв 1хв 1хв 1хв 2хв Кількість циклів 1 40 1 6