Спосіб визначення необхідності тестування на вілінфекцію

Спосіб визначення необхідності тестування на ВІЛ-інфекцію, шляхом дослідження сироватки крові, який відрізняється тим, що у сироватку крові обстежуваного додають реагент неспецифічний для ВІЛ-інфекції з подальшим визначенням у отриманій реакційній суміші вільних небілкових SH-груп, та, у випадку їх відсутності, приймають рішення про необхідність тестування на ВІЛінфекцію. (19) (21) 97105066 (22) 16.10.1997 (24) 16.10.2000 (33) UA (46) 16.10.2000, Бюл. № 5, 2000 р. (72) Костюшов Володимир Васильович, Запорожан Валерій Миколаєвич, Карповський Юхим Якович, Костюшова Лілія Антонівна, Костюшова Наталія Володимирівна, Тимчишин Олег Львович, Морозкін Володимир Васильович 28862 особи, що знаходяться у місцях позбавлення волі, а також хворі по клінічних показниках та ін.) на наявність антитіл до ВІЛ методом ІФА. У випадку негативного результату подальші дослідження не проводять, так як вважається, що ознаки ВІЛінфекції відсутні. У тому випадку, якщо при первинному обстеженні одержаний позитивний результат, тобто методом ІФА виявлені антитіла до ВІЛ у сироватці крові, то це є основою для прийняття рішення про подальше тестування на ВІЛінфекцію з обов'язковим подальшим використанням для цих цілей верифікуючого методу дослідження - імуноблотингу. Проте відомі способи та спосіб-прототип складні, тривалі за часом виконання, вимагають значних матеріальних витрат, використання дорогих біотехнологій для виробництва тест-систем та наборів для діагностики, а також спеціальної апаратури. Окрім того, спосіб-прототип має наступні вади: - він не виключає несправжньопозитивних результатів, які можуть складати від 10 до 25%; - для уточнення специфічності способу-прототипу вимагається обов'язкове додаткове верифікуюче (дослідження, що підтверджує) дослідження в імуноблотингу; - неможливо судити про анергію, тобто про зниження реактивності імунної системи. Спосіб-прототип та імуноблотинг дублюють один одного, так як той, та другий дозволяють визначати тільки одні і ті ж етіологічні маркери, по яких важко судити про наявність власне імунодефіциту - основної патогенетичної ланки захворювання СНІД. В основу винаходу поставлена задача удосконалення способу визначення необхідності тестування на ВІЛ-інфекцію, у якому за рахунок з'єднання неспецифічних реагентів з сироваткою крові обстежуваного (СКО) одержують реакційну суміш та визначають в ній вільні небілкові SH-групи, по появі або відсутності яких з великим ступенем достовірності та об'єктивності можна запідозрити наявність або відсутність ВІЛ-інфекції та прийняти рішення про доцільність подальшого проведення верифікуючих досліджень методом іммуноблотингу, що дозволить спростити існуючий спосіб, значно підвищити об'єктивність рішення, що приймається, скоротити час на дослідження, а також значно зменшити вартість діагностичного процесу та зробити його доступним для будь-якої клініко-діагностичної лабораторії. Поставлена задача вирішується тим, що у способі визначення необхідності тестування на ВІЛінфекцію шляхом дослідження сироватки крові, згідно винаходу, у СКО додають реагент неспецифічний для ВІЛ-інфекції, з подальшим визначенням в отриманій реакційній суміші вільних небілкових SH-груп, та у випадку їх відсутності приймають рішення про необхідність подальшого тестування на ВІЛ-інфекцію, використовуючи надалі для цих цілей загальноприйнятий етіологічний, верифікуючий спосіб визначення антитіл до ВІЛ у СКО методом імуноблотингу, виключивши при цьому метод ІФА. Сутність винаходу заключається у тому, що у здорових осіб та у хворих, страждаючих гострими та хронічними захворюваннями інфекційної та неінфекційної природи, але не пов'язаної з ВІЛ інфекцією, у процесі реакції антиген-антитіло: при взаємодії їх сироватки крові, з реагентом неспецифічним для ВІЛ-інфекції, у о триманої реакційній суміші завжди з'являлись вільні небілкові SHгрупи. На відміну від ни х, у ВІЛ-інфікованих, у процесі реакції антиген-антитіло: при взаємодії СКО з реагентом неспецифічним для ВІЛ-інфекції, у отриманій реакційній суміші вільні небілкові SH-групи не визначаються, що свідчить про анергію імунної системи. Тому відсутність у такій реакційній суміші вільних небілкових SH-груп, може служити основою для прийняття рішення про необхідність подальшого тестування на ВІЛ-інфекцію. Сутність винаходу пояснюється малюнками. На фіг. 1 зображений графік залежності показників вмісту вільних небілкових SH-груп у реакційних сумішах при постановці реакції антиген-антитіло у здорових осіб. На фіг. 2 зображений графік залежності цих показників у хворих, у яких мали місце гострі та хронічні захворювання інфекційної та неінфекційної природи, але не зумовлені ВІЛ-інфекцією. На фіг. 3 зображений графік залежності цих показників у хворих, у яких виявлена ВІЛ-інфекція. По вісі абсцис позначена реакційна суміш: сироватка крові обстежуваного + моноспецифічна сироватка проти імуноглобулінів або С 3 компонента комплемента, а по вісі ординат - вміст вільних небілкових SH-гр уп в реакційній суміші. Аналіз технічного рішення, що пропонується, дозволив виявити наступні відрізнення від способу-прототипу: - з'єднання СКО з реагентом неспецифічним для ВІЛ-інфекції з метою прийняття рішення про необхідність подальшого тестування на ВІЛінфекцію; - визначення в отриманій реакційній суміші: "СКО + реагент неспецифічний для ВІЛ-інфекції" вільних небілкових SH-груп, відсутність яких вказує на необхідність подальшого тестування на ВІЛ-інфекцію. Запропонована сукупність ознак дозволить з великою імовірністю припустити ВІЛ-інфекцію у обстежуваного, а також більш обгрунтовано та об'єктивно прийняти рішення про необхідність подальшого тестування на ВІЛ-інфекцію. Відомий спосіб визначення необхідності тестування на ВІЛ-інфекцію за результатами дослідження СКО на антитіла до ВІЛ у ІФА, але невідомий спосіб визначення необхідності тестування на ВІЛ-інфекцію по наявності або відсутності вільних небілкових SH-груп у реакційній суміші, що складається з СКО, з'єднаної з реагентом неспецифічним для ВІЛ-інфекції. Відомо визначення вмісту вільних небілкових SH-груп у еритроцитах, лейкоцитах, сироватці крові, наприклад, для діагностики захворювань крові, інфарктів внутрішніх органів та інш., але невідомо визначення вільних небілкових SH-груп у реаційній суміші, що складається з СКО, з'єднаної з реагентом неспецифічним для ВІЛ-інфекції з метою визначення необхідності подальшого тестування на ВІЛ-інфекцію. Відомий спосіб визначення антитіл до ВІЛ по наявності вільних небілкових SH-груп у реаційній суміші: СКО, з'єднана з антигеном ВІЛ, але не відомий спосіб визначення необхідності подальшого 2 28862 тестування на ВІЛ-інфекцію по відсутності вільних небілкових SH-груп у реакційній суміші, що складається з СКО, з'єднаної з реагентом неспецифічним для ВІЛ-інфекції. Спосіб, що пропонується нами, здійснюється таким чином. У обстежуваного, з дотримуванням правил асептики, здійснюють забір венозної крові у суху стерильну пробірку та доставляють у лабораторне відділення. Одержують сироватку крові загальноприйнятим способом. Потім ставиться реакція антиген-антитіло, для чого у СКО додають неспецифічний для ВІЛ-інфекції реагент, наприклад, одну з моноспецифічних сироваток проти імуноглобулінів або С3-компонента комплемента, у співвідношенні 10:1 та здійснюють термостатування такої реакційної суміші при температурі 37°С, протягом 30 хвилин. В отриманій реакційній суміші досліджують вміст вільних небілкових SH-гр уп методом амперометричного титрування (АМТ), на розробленому нами пристрої для АМТ (заявка № 96124935, від 27.12.1996, позитивне рішення від 11.07.1997). Відсутність вільних небілкових SHгруп у реакційній суміші вказує на анергію імунної системи та служить основою для прийняття рішення про необхідність подальшого тестування обстежуваних на ВІЛ-інфекцію. Нами було обстежено по потребі 1383 осіб, які були поділені на такі групи: І група (контрольна) 851 здорових осіб; II група (група порівняння) 491 хворий, у яких мали місце гострі та хронічні захворювання інфекційної та неінфекційної природи, але не зумовлені ВІЛ-інфекцією; III гр упа - 41 хворий, у яких виявлена ВІЛ-інфекція. При визначенні необхідності тестування на ВІЛ-інфекцію по способу, що пропонується, нами використовувались такі неспецифічні для ВІЛінфекції реагенти: моноспецифічні сироватки проти імуноглобулінів М, G, А та С3 компонента комплемента (відповідно МСС IgM, MCC IgG, МСС ІgА, МСС С3), виробництва фірм Sevac (Чехія), Kone Instruments (Фінляндія) та ГНДІЄМ м. Н.Новгород (Росія). Підготовка та розведення МСС здійснювалась згідно інструкції, що прикладається до них. Для порівняння, паралельно з способом, що пропонується нами, проводились дослідження за способом-прототипом. Згідно даних представлених на фіг. 1, 2 та 3 видно, що тільки у III гр упі обстежених (ВІЛ-інфіковані), у реакційних сумішах: СКО + МСС Ig M, СКО + МСС IgG, СКО + МСС ІgА, СКО + МСС С3 відсутні вільні небілкові SH-групи, що свідчить про анергію імунної системи та необхідності подальшого тестування на ВІЛ-інфекцію. Встановлено, що чутливість способу, що пропонується нами, не відрізнялась від способупрототипу, а специфічність була вище, ніж у способу прототипу (таблиця). Приклади конкретного виконання Приклад 1. У обстежуваного Г-ра, з дотримуванням правил асептики, здійснювали забір венозної крові у суху стерильну пробірку та одержували сироватку крові загальноприйнятим способом. У заздалегідь приготовлену іншу пробірку відбирали 900 мкЛ СКО та до неї додавали 100 мкЛ МСС Ig M, після чого здійснювали термостатування реакційної суміші при температурі 37°С, протягом 30 хвилин. Потім у реакційній суміші визначали вільні небілкові SH-групи, вміст яких склав 0 мкМ/л. Такі дані вказують на анергію імунної системи та необхідність подальшого тестування на ВІЛінфекцію. При визначенні способом-прототипом у СКО Гра були виявлені антитіла до ВІЛ, що також вказувало на необхідність подальшого тестування на ВІЛ-інфекцію. Проведене верифікуюче дослідження методом імуноблотингу підтвердило результат досліджень. Приклад 2. У обстежуваного К-на, що знаходиться на стаціонарному лікуванні у 411 ОВГ з діагнозом: сепсіс, повільнотекуча течія, з дотримуванням правил асептики, здійснювали забір венозної крові у суху стерильну пробірку та одержували сироватку крові загальноприйнятим способом. У заздалегідь приготовлену іншу пробірку відбирали 900 мкЛ СКО та до неї додавали 100 мкЛ МСС IgG, після чого здійснювали термостатування реакційної суміші при температурі 37°С, протягом 30 хвилин. Потім у реакційній суміші визначали вільні небілкові SH-групи, вміст яких склав 0 мкМ/л. Такі дані вказують на анергію імунної системи та необхідність подальшого тестування на ВІЛінфекцію. При визначенні способом-прототипом у сироватці СКО К-на були виявлені антитіла до ВІЛ, що також вказувало на необхідність подальшого тестування на ВІЛ-інфекцію. Проведене верифікуюче дослідження методом імуноблотингу підтвердило результат досліджень. Приклад 3. У обстежуваного А-ва, з дотримуванням правил асептики, здійснювали забір венозної крові у суху стерильну пробірку та одержували сироватку крові загальноприйнятим способом. У заздалегідь приготовлену іншу пробірку відбирали 900 мкЛ СКО та до неї додавали 100 мкЛ MCC IgA, після чого здійснювали термостатування реакційної суміші при температурі 37°С, протягом 30 хвилин. Потім у реакційній суміші визначали вільні небілкові SH-групи, вміст яких склав 0 мкМ/л. Такі дані вказують на анергію імунної системи та необхідність подальшого тестування на ВІЛ-інфекцію. При визначенні способом-прототипом у СКО А-ва були виявлені антитіла до ВІЛ, що також вказувало на необхідність подальшого тестування на ВІЛ-інфекцію. Проведене верифікуюче дослідження методом імуноблотингу підтвердило результат досліджень. Приклад 4. У обстежуваного Ю-ко, з дотримуванням правил асептики, здійснювали забір венозної крові у суху стерильну пробірку та одержували сироватку крові загальноприйнятим способом. У заздалегідь приготовлену іншу пробірку відбирали 900 мкЛ СКО та до неї додавали 100 мкЛ МСС С 3, після чого здійснювали термостатування реакційної суміші при температурі 37°С, протягом 30 хвилин. Потім у реакційній суміші визначали вільні небілкові SH-групи, вміст яких склав 0 мкМ/л. Такі дані вказують на анергію імунної системи та необхідність подальшого тестування на ВІЛ-інфекцію. При визначенні способом-прототипом у СКО Ю-ко були виявлені антитіла до ВІЛ, що також вказувало на необхідність подальшого тестування на ВІЛ-інфекцію. 3 28862 Проведене верифікуюче дослідження методом імуноблотингу підтвердило результати досліджень. Приклад 5. У обстежуваного Ф-ва, з дотримуванням правил асептики, здійснювали забір венозної крові у суху стерильну пробірку та одержували сироватку крові загальноприйнятим способом. У заздалегідь приготовлену іншу пробірку відбирали 900 мкЛ СКО та до неї додавали 100 мкЛ MCC Ig M, після чого здійснювали термостатування реакційної суміші при температурі 37°С, протягом 30 хвилин. Потім у реакційній суміші визначали вільні небілкові SH-групи, вміст яких склав 15 мкМ/л. Такі дані вказують на відсутність анергії імунної системи та на те, що немає необхідності подальшого тестування на ВІЛ-інфекцію. При визначенні способом-прототипом у СКО антитіла до ВІЛ не були виявлені, що також вказувало на відсутність показань до подальшого тестування на ВІЛ-інфекцію. Приклад 6. У обстежуваного Г-ко, з дотримуванням правил асептики, здійснювали забір венозної крові у суху стерильну пробірку та одержували сироватку крові загальноприйнятим способом. У заздалегідь приготовлену іншу пробірку відбирали 900 мкЛ СКО та до неї додавали 100 мкЛ MCC IgG, після чого здійснювали термостатування реакційної суміші при температурі 37°С, протягом 30 хвилин. Потім у реакційній суміші визначали вільні небілкові SH-групи, вміст яких склав 31 мкМ/л. Такі дані вказують на відсутність анергії імунної системи та на те, що немає необхідності подальшого тестування на ВІЛ-інфекцію. При визначенні способом-прототипом у СКО антитіла до ВІЛ не були виявлені, що також вказувало на відсутність показань до подальшого тестування на ВІЛ-інфекцію. Приклад 7. У обстежуваного І-ко, з дотримуванням правил асептики, здійснювали забір венозної крові у суху стерильну пробірку та одержували сироватку крові загальноприйнятим способом. У заздалегідь приготовлену іншу пробірку відбирали 900 мкЛ СКО та до неї додавали 100 мкЛ MCC IgA, після чого здійснювали термостатування реакційної суміші при температурі 37°С, протягом 30 хвилин. Потім у реакційній суміші визначали вільні небілкові SH-групи, вміст яких склав 30 мкМ/л. Такі дані вказують на відсутність анергії імунної системи та на те, що немає необхідності подальшого тестування на ВІЛ-інфекцію. При визначенні способом-прототипом у СКО антитіла до ВІЛ не були виявлені, що також вказувало на відсутність показань до подальшого тестування на ВІЛ-інфекцію. Приклад 8. У обстежуваного М-кого, з дотримуванням правил асептики, здійснювали забір венозної крові у суху стерильну пробірку та одержували сироватку крові загальноприйнятим способом. У заздалегідь приготовлену іншу пробірку відбирали 900 мкЛ СКО, та до неї додавали 100 мкЛ МСС С3, після чого здійснювали термостатування реаційної суміші при температурі 37°С, протягом 30 хвилин. Потім у реакційній суміші визначали вільні небілкові SH-групи, вміст яких склав 15 мкМ/л. Такі дані вказують на відсутність анергії імунної системи та на те, що немає необхідності подальшого тестування на ВІЛ-інфекцію. При визначенні способом-прототипом у СКО антитіла до ВІЛ не були виявлені, що також вказувало на відсутність показань до подальшого тестування на ВІЛ-інфекцію. Приклад 9. У обстежуваного Д-ко, що знаходиться на стаціонарному лікуванні у 411 ОВГ з діагнозом: вогнищевий туберкульоз легень у фазі інфільтрації та розпаду, МБТ+ з дотримуванням правил асептики, здійснювали забір венозної крові у суху стерильну пробірку та одержували сироватку крові загальноприйнятим способом. У заздалегідь приготовлену іншу пробірку відбирали 900 мкЛ СКО та до неї додавали 100 мкЛ МСС ІgА, після чого здійснювали термостатування такої реаційної суміші при температурі 37°С, протягом 30 хвилин. Потім у реакційній суміші визначали вільні небілкові SH-гpyпи, вміст яких склав 20 мкМ/л. Такі дані вказують на відсутність анергії імунної системи та на те, що немає необхідності подальшого тестування на ВІЛ-інфекцію. При визначенні способом-прототипом у СКО антитіла до ВІЛ не були виявлені, що також вказувало на відсутність показань до подальшого тестування на ВІЛ-інфекцію. Приклад 10. У обстежуваного І-ва, що знаходиться на стаціонарному лікуванні у 411 ОВГ з діагнозом: хронічний пієлонефрит, стадія загострення, з дотримуванням правил асептики, здійснювали забір венозної крові у суху стерильну пробірку та одержували сироватку крові загальноприйнятим способом. У заздалегідь приготовлену іншу пробірку відбирали 900 мкЛ СКО та до неї додавали 100 мкЛ MCC IgG, після чого здійснювали термостатування реаційної суміші при температурі 37°С, протягом 30 хвилин. Потім у реакційній суміші визначали вільні небілкові SH-групи, вміст яких склав 25 мкМ/л. Такі дані вказують на відсутність анергії імунної системи та на те, що немає необхідності подальшого тестування на ВІЛ-інфекцію. При визначенні способом-прототипом у СКО антитіла до ВІЛ не були виявлені, що також вказувало на відсутність показань до подальшого тестування на ВІЛ-інфекцію. Приклад 11. У обстежуваного К-к, що знаходиться на стаціонарному лікуванні 411 ОВГ з діагнозом: вірусний гепатит В, жовтушна форма, важка течія, з дотримуванням правил асептики, здійснювали забір венозної крові у суху стерильну пробірку та одержували сироватку крові загальноприйнятим способом. У заздалегідь приготовлену іншу пробірку відбирали 900 мкЛ СКО та до неї додавали 100 мкЛ MCC ІgМ, після чого здійснювали термостатування реаційної суміші при температурі 37°С, протягом 30 хвилин. Потім у реакційній суміші визначали вільні небілкові SH-групи, вміст яких склав 13 мкМ/л. Такі дані вказують на відсутність анергії імунної системи та на те, що немає необхідності подальшого тестування на ВІЛінфекцію. При визначенні способом-прототипом у СКО антитіла до ВІЛ не були виявлені, що також вказувало на відсутність показань до подальшого тестування на ВІЛ-інфекцію. Приклад 12. У обстежуваного М-ко, що знаходиться на стаціонарному лікуванні у 411 ОВГ з діагнозом: бактеріальний ендокардит, гостра течія, з дотримуванням правил асептики, здійснювали за 4 28862 бір венозної крові у суху стерильну пробірку та одержували сироватку крові загальноприйнятим способом. У заздалегідь приготовлену іншу пробірку відбирали 900 мкЛ СКО та до неї додавали 100 мкЛ МСС С3, після чого здійснювали термостатування реаційної суміші при температурі 37°С, протягом 30 хвилин. Потім у реакційній суміші, що досліджується визначали вільні небілкові SHгрупи, вміст яких склав 16 мкМ/л. Такі дані вказують на відсутність анергії імунної системи та на те, що немає необхідності подальшого тестування на ВІЛ-інфекцію. При визначенні способом-прототипом у СКО антитіла до ВІЛ не були виявлені, що також вказувало на відсутність показань до подальшого тестування на ВІЛ-інфекцію. Отримані дані свідчать, що спосіб, який пропонується нами, є більш інформативним, має високу діагностичну цінність, причому проводиться без використання загальноприйнятих наборів для скринінгу антитіл до ВІЛ-1 та ВІЛ-2 у ІФА та не вимагає дорогого спеціального устаткування, доступний до широкого застосування у різних медичних установах. Таблиця Порівняна оцінка способу, який пропонується, та способу-прототипу при визначенні необхідності тестування на ВІЛ-інфекцію. Визначена необхідність тестування на ВІЛ-інфекцію Способом, який пропонується Способом-прототипом Група обстежуваних І гр упа II гр упа III група Обстежено осіб Всього 851 491 41 3 них підтверджено у імуноблотингу Всього 3 них підтверджено у імуноблотингу 0 0 41 0 0 41 0 7 41 0 0 41 Фіг. 1 5 28862 Фіг. 2 Фіг. 3 6 28862 __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2002 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 34 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 7