Спосіб прогнозування гаплопродукційної здатності генотипів озимої м`якої пшениці на основі цитологічного моніторингу першого етапу культури пиляків in vitro

Спосіб прогнозування гаплопродукційної здатності генотипів озимої м'якої пшениці на основі 3 33983 ном гіпохлориту кальцію. Виділенні пиляки висаджують на первинне середовище 190-2 у модифікації [6]. Культивують перші 3 доби у темряві при температурі 30°С, далі при 24°С до появи новоутворень (до 30-35 діб культивування). 2. Тестування реалізують шляхом випадкового відбору з пробірки 10 пиляків, які використовуються для приготування тимчасових оцтокармінових препаратів. На одне предметне скло кладуть 3-4 пиляка в краплю оцтокарміну, скальпелем подрібнюють їх до кашоподібної маси, накривають покривним склом і злегка натискають. За дефіциту рідини - додають краплю 45% оцтової кислоти. Виготовлені препарати досліджуються під мікроскопом при збільшенні окуляра 10х і об'єктиву 10х. У 10 полях зору підраховують кількість мікрослор, що розвиваються по спорофітному шляху, розбиваючи їх на класи по морфології - багатоядерні, багатоклітинні. Кожен генотип досліджується темпорально три рази: через 10, 15 та 20-25 діб культивування in vitro, причому в кожен наступний термін для дослідження беруть іншу пробірку (випадково). При складанні прогнозу гаплопродукційної здатності того або іншого генотипу враховують наступні параметри: - кількість та час появи багатоядерних та багатоклітинних стр уктур; - наявність ембріоїдоподібних структур; - масовий вихід новоутворень на поверхню пиляків. Приклад 1. Проводили оцінку ефективності запропонованого способу на різних генотипах пшениці: 8 сортів озимої м'якої пшениці, 4 ізогенні лінії, 6 рекомбінантних ліній по генам росту та розвитку. Пиляки висаджували на два живильних середовища - Р-2 та 190-2. Результати проведеного цитологічного тестування першого етапу формоутворюючих процесів в культурі пиляків пшениці дозволили оцінити здатність кожного генотипу до гаплопродукції. Критерієм в експерименті служила швидкість появи новоутворень, характерних для спорофітної програми в культурі пиляків in vitro (від 15 до 25 доби культивування). Виявлена нега 4 тивна кореляція між швидкістю формування новоутворень та їх кількістю (r=-0,74). Показана специфічна реакція окремих генотипів на різні живильні середовищах при культивуванні пиляків in vitro. В результаті цитологічного тестування перших етапів морфогенезу в - культурі пиляків пшениці було показано, що при роботі з генотипами озимої м'я кої пшениці бажано використовувати не менше двох різних варіантів живильних середовищ. Приклад 2. Здійснювали оцінку ефективності запропонованого способу на 14 гібридних генотипах із популяції F3 однієї комбінації схрещування Т. aestivum ´ Ae. cylindrica. При складанні прогнозу гаплопродутщійної здатності того чи іншого генотипу оцінювали частоту клітин, які розвивалися за спорофітною програмою та швидкість появи новоутворень на поверхні пиляків. За результатами дослідження виділились три групи генотипів: перша (№286, 298 та 310) - форми, які мали найвищій відсоток морфогенних мікроспор в культурі пиляків на 20 добу культивування; друга (№293, 312, 321) - з середнім значення цього показника і третя група з дуже низьким відгуком в культурі пиляків in vitro, у яку ввійшли усі інші генотипи. Надалі, як правило, саме генотипи з більш високим відсотком морфогенних мікроспор формували більше новоутворень (табл.1). Виявлено позитивну кореляцію (r=0,55) між цими показниками. Іншим важливим показником, що використовували в якості тестера ефективності морфогенезу в культурі пиляків м'я кої пшениці, була швидкість формування новоутворень, тобто час від висадки пиляків на індукційне живильне середовище до масової появи новоутворень на їх поверхні. Виявлено достовірний негативний кореляційний зв'язок (r=-0,58) між цим показником та процентом регенерації зелених рослин в культурі пиляків пшениці (табл.2). Доведена принципова можливість прогнозування рівня здатності до андрогенезу окремих генотипів пшениці після 20-30 діб культивування in vitro на основі аналізу параметрів “відсоток морфогенних мікроспор” та “швидкість формування новоутворень”. Таблиця 1 Тестування першого етапу андрогенезу in vitro в к ультурі пиляків гібридів озимої м'якої пшениці № п/п Кількість мікроспор, що вивчали, шт. 1 286 290 292 293 294 297 298 306 309 2 »8000 »9000 »8000 »9000 »12000 »8000 »2000 »8000 »9000 Життєздатні мікроспори на 18-20 доба культивування шт. відсоток* 3 4 56 0,7 10 0,11 8 0,1 35 0,39 6 0,05 3 0,04 44 2,2 4 0,04 Новоутворення шт. 5 7 52 30 15 18 29 82 10 33 відсоток** 6 0,58 2,6 1,2 1,5 1,5 1,61 4,82 0,77 2,2 5 33983 6 Продовження таблиці 1 1 310 311 312 313 321 2 »12000 »9000 »12000 »9000 »9000 3 85 13 20 11 27 4 0,71 0,14 0,17 0,12 0,3 5 73 8 8 21 25 6 7,3 0,62 0,5 1,75 1,39 *- відсоток від мікроспор, що вивчали; ** - відсоток від висаджених пиляків. Таблиця 2 Регенерація in vitro в культурі пиляків гібридів озимої м'якої пшениці № п/п 286 290 292 293 294 297 298 306 309 310 311 312 313 321 Час масової поКількість пиляків, яви новоутвощо висадили рень, доба культивування 1200 27-30 2000 22-25 2500 25-28 1000 25-28 1200 28-30 1800 28-30 1700 23-25 1300 35-37 1500 27-30 1000 27-30 1300 37-40 1600 37-40 1200 37-40 1800 27-30 Різогенез Зелені Шт. % шт. % шт. % 1 2 0,1 0,15 1 1 0,04 0,1 4 2 1 3 3 1 1 0,2 0,08 0,08 0,18 0.2 0,1 0,08 Джерела інформації: 1. Игнатова С.А. Биотехнологические основы получения гаплоидов, отдаленных гибридов и соматических регенерантов зерновых и бобовых культур в различных системах in vitro: Автореф. дис. д-ра биол. наук: 03.00.20 /Ялта, 2004. -47с. 2. Катасонова А.А., Шаяхметов И.Ф., Кр углова Н.Н. Этапы биотехнологии получения растенийрегенерантов яровой мягкой пшеницы путем эмбриоидогенеза в каллусной культуре in vitro //Известия Челябинского научного центра. -2006. вып.2 (32). -С.24-31. 3. Лобанова K.I., Жосонар М.В., Ігнатова С.О. Шляхи реалізації регенераційного потенціалу в культурі пиляків у різних генотипів озимої м'якої пшениці //Вісник українського товариства генетиків і селекціонерів. -2006. -Том4, №1. -С.52-57. 4. Игнатова С А., Задерей Н.С, Шестопал О.Л. Прогнозирование способности к гаплопродукции мягкой пшеницы в культуре пыльников //Тез. докл. Комп’ютерна в ерстка C.Литв иненко Альбіно Межд. конф. Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология. - Москва, Минск. -2001. -С.58. 5. Жосонар М.В., Шестопал О.Л. Вивчення етапів морфогенезу в культурі пиляків пшениці //Тез. Всеукр. конф. Молодих вчених. -Інститут агроекології і біотехнології, Київ, 28-30 жовтня. 2002. -С.121-122. 6. Ігнатова С.О., Файт В.I., Жосонар М.В., Шестопал О.Л. Прогнозування відгуку генотипів озимої м'якої пшениці в культурі пиляків на основі тестування етапів морфогенезу //Аграрний вісник Причорномор'я . -вип.18, 2002. -С.14-17. 7. Шестопал О.Л., Ігнатова С.О. Цитологічний моніторинг ефективності морфогенезу в культурі пиляків м'якої пшениці для оцінки її здатності до андрогенезу //Фактори експериментальної еволюції організмів: 36. наук. праць. -Т.3. /За ред. Роїка. К.: Логос, 2006. -С.527-531. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601