Спосіб оцінки формування специфічної імунної відповіді у онкологічних хворих після проведення дендритноклітинної вакцинотерапії

Спосіб оцінки формування специфічної імун 3 34590 розробити спосіб оцінки формування специфічної імунної відповіді у онкологічних хворих після проведення дендритноклітинної вакцинотерапії шляхом проведення реакції бласттрансформації (РБТЛ) з аутологічним пухлинним антигеном (ПА), що дасть можливість оцінити ефективність специфічної імунної відповіді після проведення вакцинотерапії. Поставлена задача вирішується наступним чином: У хворих беруть кров вранці натщесерце з локтьової вени з дотриманням правил асептики. Для проведення РБТЛ використовують мононуклеари периферичної крові хворого, які виділяють на градієнті щільності фікола (r = 1,077) потім клітини двічі відмивають центрифугуванням в середовищі 199 і підраховують. Для постановки РБТЛ необхідно довести концентрацію клітин до 1´106/мл в повному культуральному середовище (ПКС) з додаванням 10% фетальної телячої сироватки та культивувати в об’ємі 1мл у 24-луночному планшеті (Sarstedt) при 37°С в атмосфері 5% СО2 протягом 7 діб. На 1-шу та 3-тю добу додавали 5мкл інтерлейкіну 2. Клітинну суспензію переносили у цитометричні пробірки, осаджували клітини центрифугуванням, потім додавали 200мкл забуференого фізрозчина (ЗФР), 300мкл розчину Triton X, 10мкл РНК-зи та 10мкл пропідій йодида, інкубували 10 хвл при 37°С потім 30 хвл при кімнатній температурі. Клітини відмивали центрифугуванням, зразки оцінювали за допомогою проточного цитофлюориметра. Всі дослідження проведені за допомогою проточного цитофлюориметра FACScan (Becton Dickinson, США), обладнаного аргоновим лазером з довжиною хвилі 488нм, за допомогою програми Cell Quest для комп’ютерів Мас. Для оцінки вмісту клітин в основних фазах клітинного циклу використовували математичну програму Mod Fit LT 2.0 (США). Активація лімфоцитів, що супроводжується 4 процесами проліферації і диференціювання, відбувається під впливом стимулюючего сигналу. Перехід клітин із стану спокою (G0/G1 фаза клітинного циклу) в стан проліферації (G2/M + S фази клітинного циклу) свідчить про формування специфічної імунної відповіді на подразнювач [6]. При збільшенні відсотка лімфоцитів, які проліферують, під впливом ПА по відношенню до кількості проліферуючи х клітин в контролі ми можемо констатувати формування специфічної імунної відповіді після проведення вакцинотерапії. Переконливими прикладами ефективності запропонованого способу є представлені функціональні тести двох хворих. І. Хворий С.М.М. 1946 року народження (історія хвороби №734) поступив у відділення торакальної онкології з діагнозом Са верхньої долі правої легені, ПГЗ №2301-8/07: залозистий Са, TNM: T2N2 M0 , 2 клінічна група, проведена операція верхня білобектомія. У хворого взяли кров вранці натщесерце з локтьової вени з дотриманням правил асептики. Для проведення РБТЛ використали мононуклеари периферичної крові хворого, які виділяли на градієнті щільності фікола (r=1,077) потім клітини двічі відмивали центрифугуванням в середовищі 199 і підраховували. Для постановки РБТЛ необхідно довести концентрацію клітин до 1´106/мл в ПКС з додаванням 10% фетальної телячої сироватки та культивува ти в об’ємі 1мл у 24-луночному планшеті (Sarstedt) при 37°С в атмосфері 5% СО2 7 діб. На 1-шу та 3тю добу додавали 5мкл IL-2. Клітинну суспензію переносили у цитометричні пробірки, осаджували клітини центрифугуванням, потім додавали 200мкл ЗФР, 300мкл розчину Triton X, 10мкл РНКзи та 10мкл пропідій йодида, інкубували 10 хвл при 37°С потім 30 хвл при кімнатній температурі. Відмивали центрифугуванням, зразки оцінювали за допомогою проточного цитофлюориметра. Результати досліджень представлені в табл.1. Таблиця 1 Формування специфічної імунної відповіді визначали в РБТЛ з ПА Кількість клітин в G2/М+S фазах клітинного циклу, % Нормальні показники Лімфоцити (контроль) Лімфоцити + ПА Лімфоцити практично здорових людей Після 1-ї вакцинації Після 4-ї вакцинації 12,81±1,98 38,14 13,57 24,12 20,76 Збільшення кількості клітин, які перебувають в G2/М+S фазах клітинного циклу, тобто збільшення проліферуючих клитин, під впливом ПА вказує на формування специфічної імунної відповіді після ДК-вакцинотерапії. II. Хворий У.І.А. 1938 року народження (історія хвороби №542) поступив у відділення торакальної онкології з діагнозом Са нижньої долі правої легені, ПГЗ №1805-8/07: плоскоклітинний Са, TNM: T2N2 M0 , 2 клінічна група, проведена операція - нижня лобектомія. У хворого взяли кров вранці натшесерце з ло ктьової вени з дотриманням правил асептики. Для проведення РБТЛ використали мононуклеари периферичної крові хворого, які виділяли на градієнті щільності фікола (r=1,077) потім клітини двічі відмивали центрифугуванням в середовищі 199 і підраховували. Для постановки РБТЛ необхідно довести концентрацію клітин до 1´106/мл в ПКС з додаванням 10% фетальної телячої сироватки та культивува ти в об’ємі 1мл у 24-луночному планшеті (Sarstedt) при 37°С в атмосфері 5% СО2 7 діб. На 1-шу та 3 5 34590 тю добу додавали 5мкл IL-2. Клітинну суспензію переносили у цитометричні пробірки, осаджували клітини центрифугуванням, потім додавали 200мкл ЗФР, 300мкл розчину Triton X, 10мкл РНКзи та 10мкл пропідій йодида, інкубували 10 хвл при 6 37°С потім 30 хвл при кімнатній температурі. Відмивали центрифугуванням, зразки оцінювали за допомогою проточного цитофлюориметра. Результати досліджень представлені в табл.2. Таблиця 2 Формування специфічної імунної відповіді визначали в РБТЛ з ПА Проліферація, G2/М+S фазах клітинного циклу, % Нормальні показники Лімфоцити (контроль) Лімфоцити +ПА Лімфоцити практично здорових людей Після 1-ї вакцинації Після 4-ї вакцинації 12,81±1,98 14,12 10,81 13,42 19,94 Збільшення кількості клітин, які перебувають в G2/М+S фазах клітинного циклу, тобто збільшення проліферуючих клитин, під впливом ПА вказує на формування специфічної імунної відповіді після ДК-вакцинотерапії. Проведення РБТЛ у онкологічних хворих після ДК-вакцинотерапіїї дозволяє оцінити стан імунологічних чинників та формування специфічної імунної відповіді, на аутологічний пухлинний антиген, який використовується для навантаження ДК при проведенні вакцинотерапії. Джерела інформації: 1. А.Ю. Вершигора, Є.У. Пастер, Д.В. Колибо та ін., Імунологія// - К.: Ви ща школа, 2005. - 599с. 2. Identification and Functional Characterization of Human CD4+ CD25+ T Cell with Regulatory Properties Isolated from Peripheral Blood.// H.Jonuleit, E. Schmitt, M. Strassen, A. Tuettenberg, J. Knop, H. Enk// J.Exp. Med. - 2001. - V.193. - N.11. Комп’ютерна в ерстка А. Крулевський - P.1285-1293. 3. Вакцины на основе дендритных клеток в лечении злокачественных опухолей// И.А. Балдуева. - V Российская онкологическая конференция, 2729 ноября 2001г., г.Москва. 4. Особенности иммунного статуса больных раком предстательной железы// А.Н. Бедняков, А.Т. Токтошев, З.П. Камарли// Вестник КРСУ. - №7, 2003. 5. Фенотип иммунокомпетентных клеток у онкологических больных при вакцинотерапии// Борунова А.Н. - Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. 2006г. - РОНЦ АМН Российской Федерации, Москва (прототип). 6. Апоптоз и пролиферация как альтернативные формы ответа Т-лимфоцитов на стимуляцию// Клеточная иммунология. - №2, 1999. - С.20-23. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601