Спосіб тестування біологічно активних сполук на їх придатність як лікарських засобів

Спосіб тестування біологічно активних сполук на їх придатність як лікарських засобів шляхом інкубування сполук з культурами клітин ссавців в системі in vitro та з наступною оцінкою життєздатності та проліферації клітин МТТ-колориметричним методом, який відрізняється тим, що як культур у клітин використовують багатоклітинні сфероїди. (19) (21) u200805219 (22) 22.04.2008 (24) 26.08.2008 (46) 26.08.2008, Бюл.№ 16, 2008 р. (72) ГАРМАНЧУК ЛЮДМИЛА ВАСИЛІВНА, UA, ПЕРЕПЕЛИЦІНА ОЛЕНА МИ ХАЙЛІВНА, UA, СИДОРЕНКО МИХАЙЛО ВАСИЛЬОВИЧ, UA (73) ВІДДІЛЕННЯ БІОТЕХНІЧНИ Х ПРОБЛЕМ ДІАГНОСТИКИ ІНСТИТУТУ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ ТА КРІОМЕДИЦИНИ НАН УКРАЇНИ, U A 3 35037 доступнішої та якіснішої культури клітин ссавців in vitro, що дозволить підвищити чутливість та інформативність способу для оцінки максимального лікарського ефекту сполук, що тестуються. Поставлена задача вирішується тим, що в способі тестування біологічно активних сполук на їх придатність у якості лікарських засобів шляхом інкубування сполук з культурами клітин ссавців in vitro в якості мішені використовують багатоклітинні сфероїди. Використання багатоклітинних сфероїдів, що являють собою трьохвимірну культуру клітин з ієрархією клітин, наближеною до системи in vivo, дозволить вивчати лікарську реактивність не тільки цільових тканин та клітин, а й мішеней-клітин конкретного хворого, які будуть використані для генерації сфероїдів. Спосіб тестування з використанням багатоклітинних сфероїдів буде більш інформативним стосовно впливу лікарського засобу не тільки на окремі клітини, а й на клітинну субпопуляцію, міжклітинну комунікацію, ступінь диференціації клітин та їхнє мікрооточення, порівняно зі способами, в яких використовують моношарову культур у клітин. Процес генерації сфероїдів не потребує багато часу та ресурсів, є досить простим у виконанні та безпечним [4]. Суть корисної моделі полягає у наступному: біологічно активні сполуки, що підлягають тестуванню, інкубують з культурою багатоклітинних сфероїдів в системі in vitro і оцінюють життєздатність та проліферацію клітин МТТколориметричним методом. Суть способу розкривають приклади конкретного виконання. Приклад 1. Для тестування використовують культур у сформованих багатоклітинних сфероїдів [4]. Культуру ретельно розносять по окремих лунках 96лункового планшету. В кожну з них додають цитокіни, що продукуються в культуральне середовище пухлинними лімфоцитами, котрі потребують тестування, у серійних розведеннях від 1:1 до 1:124 з двохкратним зменшенням та відповідним контролем у трьох повторах. Термін інкубування становить 24 години, після чого оцінюють життєздатність та проліферацію клітин в багатоклітинних сфероїдах МТТ-колориметричним методом. Для цього за 4 години до закінчення терміну інкубування до 200мкл клітинної суспензії вносять 20мкл розчину 3-[4,5-диметилтіазол-2-іл]-2,5дифенілтетразоліум броміду (МТТ) (5мг/мл фосфатно-сольового буфер у). Інкубують за тих же умов протягом 4-х годин. Після центрифугування планшету (1500об/хв, 5 хв), за допомогою напівав 4 томатичного відсмоктувача видаляють супернатант. Для розчинення кристалів формазану у кожну лунку додають 100мкл диметилсульфоксиду. Величину оптичного поглинання розчину вимірюють в одиницях абсорбціїї за допомогою мультилункового спектрофотометра при довжині хвилі 540нм (ОП540). Отримані дані порівнюють з рівнем абсорбції у контрольних зразках та підраховують рівень життєздатності клітин. Приклад 2. Для порівняння способу, що заявляється зі способом-прототипом проводили тестування цитокінів, що продук уються в культуральне середовище пухлинними лімфоцитами на моно шаровій культурі клітин за таких же умов, як зазначено у прикладі 1. Результати порівняння приведено на Фіг. Як видно з Фіг. культура багатоклітинних сфероїдів за чутливістю до дії цитокінів, що продукуються в культуральне середовище пухлинними лімфоцитами достовірно (біля 40%, р