Інгібітор трипсіноподібних протеаз як антивірусний засіб

37324 Винахід належить до ензимології та вірусології, а саме, - до клітинних ферментів, асоційованих з вірусом, і може бути використаний в медичній вірусології та ветеринарії. Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення є спосіб, який використовується для боротьби з вірусними інфекціями "Ремантадин", та його похідні, до яких включено 1 – (адемантіл) пропіламін, котрі є хімічними речовинами, що є причиною їх рідкого використання у практичній охороні здоров’я [1]. До основи винаходу поставлено задачу визначення можливості використання антивірусного засобу, який інгібує трипсиноподібні протеази, що дозволить створити на його основі ряд препаратів для лікування вірусних інфекцій, при яких розщеплення білка - пoпeредника викликається клітинними протеазами. Поставлена задача вирішується тим, що, згідно винаходу, інгібітор трипсиноподібної протеази використовують як антивірусний засіб. Запропонований засіб є інгібітором трипсиноподібних протеаз, які були виділені з легенів дужих мишей і очищені способами іонообмінної хроматографії на ДЄАЄ - целюлозі, гельфільтрацією на сефадексах, з наступною афінною хроматографією на трипсин - сефарозі 4В, з молекулярною вагою 47500 Д, що являє собою аморфну речовину, добре розчинену у дистильованій воді. Інгібітор пригнічує протеазну активність трипсиноподібних протеаз, пригнічує розмноження вірусу грипу А і В в курячих ембріонах, у культурі клітин МДСК, і який володіє захисними властивостями при експериментальному грипі на білих мишах. Критерієм противірусного впливу у першому випадку було зниження титрів інфекційної і гемагглюгинуючої активності. У другому випадку про противірусний вплив робили висновок за відсотком виживання тварин та середньою тривалістю їхнього життя. Приклад 1 (досвід 19): Антипротиолітичну дію запропонованого інгібітору вивчали на трипсиноподібних протеазах білих мишей. З легенів 100 шт. дужих білих мишей, роду "Baівa", вагою 14-16 г було виділено 8 ізоферментів, які володіють протеазною активністю, і один їх інгібітор. Виділений інгібітор придушував протеазну активність ізоферментів трипсиноподібних протеаз в неоднаковій кількості. Наслідки досліджень антипротиолітичої дії препарату (ІПА) зображені на фіг., а. Приклад II (досвід 3): Вивчення дії клітинного інгібітора трипсиноподібніх протеаз на розвиток вірусу грипу у курячих ембріонів. Було вивчено дію інгібітору протеаз на 900 шт. курячих ембріонів, інфікованих вірусом групу А. Одинадцятиденні курячі ембріони було розбито на 5 груп: І група – в ембріони було введено по 0,2 мл вірусу групу А/АРR/8/34 з інфекційним титром 5,0-5,5 lg ЕІД 50/0,2 мл і титром гемагглютиніну 1:64, 1:128 в 0,2 мл; ІІ група – вводили вірус грипу А в тій самій дозі з додатком трипсину кристалічного в дозі 2 мкг на ембріон; ІІІ група – вводили вірус грипу А з додатком клітинного інгібітору трипсиноподібних протеаз, у дозі 2 мкг на ембріон; IV група – вводили вірус грипу А з додатком інгібітору клітинного і трипсіну, в дозі 2 мкг на ембріон; V група – вводили вірус грипу А з додатком вірусіндукованого інгібітору трипсиноподібних протеаз (досвід 18), у дозі 2 мкг на ембріон. Після зараження курячі ембріони інкубували 48 годин у термостаті зі зволоженням повітря температурою 36-37°С, після чого їх охолоджували 16-18 годин за температурою 3-4°С. Після охолодження відбиралася стерильна аллантоїсна рідина, в якій визначалася протеазна, інгібіторна, інфекційна і гемагглютинуюча активності і загальний білок. Як показують висновки, зображені на фіг., б (ІІ група), введення трипсину разом з вірусом грипу А, пригноблювало загальний білок і стимулювало інфекційну активність. У II групі, введений клітинний інгібітор пригнічував інфекційну, гемагглютинуючу активність та загальний білок. У ІV групі додаток кристалічного трипсину разом з клітинним інгібітором не пригнічував утворення загального білку, але гемагглютинуюча та інфекційна активність різко спадали. У V групі не додавали вірусіндукований інгібітор - виділений з легенів мишей, заражених вірусом грипу APR/8/34 не відлічалося пригнічування інфекційної та гемагглютинуючої активності. Таким чином, інгібітор трипсиноподібних протеаз, виділений з легенів дужих мишей, володіє здібністю пригнічувати розвиток інфекційної і гемагглютинуючої активності вірусу грипу, у той час як інгібітор, виділений з легенів інфікованих мишей, цією здібності не мав. Приклад 3: Дія клітинного інгібітору на виживання мишей, які інфіковані летальною дозою вірусу грипу АРR/8/34. Висновки досліджень оцінювализа відсотком виживання мишей. Дані досліджень наведені в таблиці 1. Вони свідчать про те, що клітинний інгібітор трипсиноподібних протеаз під час інтранозального введення мишам у дозі 18 мкг/мишу 1 раз на день, щоденно, протягом 5 діб, мав висловлений захисний ефект. Крім того, інгібітор трипсиноподібних протеаз не виявляв токсичності у тварин. Вони залишалися живими і на 14 добу після введення інгібітору (термін спостерігання). Таким чином, препарат - інгібітор трипсиноподібних протеаз мав високу антивірусну активність і може бути використаний не тільки при грипі, а й при інших вірусних інфекціях, у яких розщеплення білка попередника виконується клітинними протеазами. Джерела інформації: 1. Поліс Я.Ю., Грава И.Я., Індулен М.К., Каналь И.А., Дзегузе Д.Р. Лікувальний та профілактичний протигрипозний засіб "Адапромін" // Методичні указання фармакологічного комітету М3 УРСР, 1971. - С. 5. 37324 Таблиця 1 Вплив клітинного інгібітору трипсиноподібних протеаз на виживання мишей, інфікованих летальною дозою вірусу грипу APR/8/34 Назва групи 1. Вірус грипу 2. Вірус грипу + трипсин кристалічний 3. Вірус грипу + клітинний інгібітор протеази 4. Клітинний інгібітор протеази 5. Трипсин 6. Фосфатний буфер К-ть тварин у групі 40 Доза вірусу APR/8/34 (VІІ пасаж) 10-3 Доза інгіб. на мишу щодо білка пало вижило 40 % захищених тварин 0 40 10-3 18 мкг 40 0 40 10-3 18 мкг 7 33 82,5 40 10-3 18 мкг 40 100 10 10 18 мкг 0,2 10 10 100 100 Кількість тварин 37324 (а): Дія клітинного інгібітору на протеану активність ізоферментів трипсиноподібних протеаз, виділених з нормальних легенів □ інгібітор; білок; ▒ протеаза;g протеаза+інгібітор 1 – вихідний матеріал після діалізу (б) Дія інгібіторів, виділених з легенів мишей до інфікування і після інфікування вірусом грипу APR 8/34, на розвиток вірусу грипу у курячих ембріонах через 48 годин після інфікування білок; інгібуюча активність; □ інфекційна активність; ▒ протеаза; g гемагглютинуюча активність 1 – вірус; 2 – вірус+трипсин; 3 – вірус+інгібітор; 4 – вірус+інгібітор+трипсин (досвід № 16); 5 – вірус+інгібітор (досвід № 18) Фіг. (а, б)