Протизапальний засіб

Протизапальний засіб, який включає регуляторні білки плазми крові людини, в тому числі альбумін, бета-гама-глобуліни, відрізняється тим, що додатково містить полівалентний інгібітор альфа2-макроглобулін при наступному співвідношенні компонентів, мас. %: альбумін - 1-3; альфа-2-глобуліни - 35-45; бета-гама-глобуліни - 54-62. (19) (21) 98126668 (22) 17.12.1998 (24) 15.05.2001 (33) UA (46) 15.05.2001, Бюл. № 4, 2001 р. (72) Яковенко Світлана Борисівна, Тимченко Анатолій Сергійович, Борисевич Ольга Сергіївна (73) Яковенко Світлана Борисівна, Тимченко Анатолій Сергійович, Борисевич Ольга Сергіївна 37445 лівалентного інгібітору альфа-2-макроглобуліна та інших регуляторних білків плазми крові людини при наступному співвідношенні компонентів, мас. %: альбумін - 1-3; альфа-2-глобуліни - 35-45; бета-гама-глобуліни - 54-62. Засіб отримують наступним чином : В якості вихідного продукту використовують фракцію ІІІ білків, яку одержують при промисловому виробництві препаратів крові різними модифікаціями етанолового методу Кона. Виділення концентрату альфа-2-макроглобуліна проводять в 2 етапи: 1) з метою очистки фракції ІІІ від ліпідів та гама-глобулінів її розчиняють в охолодженому 0,05 М розчині ацетату натрію (рН 6,9) до концентрації білку від 3 до 5%. Добавляють охолоджений етиловий спирт до концентрації його в суміші від 13 до 15%. В ацетатному розчині з іонною силою 0,05 при концентрації спирту 13-15% більшість молекул ліпідів та гама-глобулінів переходить в осад, який видаляють центрифугуванням; 2) в одержаному супернатанті з допомогою 1 М розчину оцотової кислоти встановлюють рН в межах 5,4±0,05 - на рівні ізоелектричної точки молекули альфа-2-макроглобуліну. Добавляють охолоджений етиловий спирт до концентрації від 23 до 25% та осаджують білок. Осад концентрату альфа-2-макроглобуліну виділяють центрифугуванням, розчиняють в 0,1% розчині хлориду натрія до концентрації білку (30±0,5) г/л, встановлюють рН в межах від 6,8 до 7,0, негайно заморожують при температурі не вище мінус 40°С та ліофілізують, використовуючи м'який режим сублімаційного висушування. Одержаний порошок добре розчинний в фізіологічних розчинах. Експериментальні досліди показали, що одержаний препарат характеризується наступними фізико-хімічними та біологічними властивостями: масова концентрація білку (0,9±0,05) мг/мг порошку; електрофоретичний склад білкових фракцій - альбумін - 1-3%, альфа-2-глобуліни - 35-45%, бетагама-глобуліни - 54-62%; специфічна активність від 0,18 до 0,25 мг функціонально активного альфа-2-макроглобуліну на 1 мг білку; препарат не виявляє гострої та хронічної токсичності. Приклад 1 Прикладом його виготовлення служить протизапальний засіб наступного складу, мас. %: альбумін – 3; альфа-2-глобуліни – 35; бета-гама-глобуліни - 62. Збільшення вмісту бета-гама-глобулінів до 62 % призводило до погіршання розчинності засобу, що спричиняло зниження його специфічної активності. Приклад 2 Збільшення вмісту альфа-2-глобулінової фракції до 45% потребувало спеціального відбору вихідної сировини - фракції ІІІ білків з високим вмістом альфа-2-макроглобуліну, що становить невеликий відсоток від її загальної кількості. Разом з тим достовірно не зростала специфічна активність засобу наступного складу, мас. %: альбумін – 1; альфа-2-глобуліни – 45; бета-гама-глобуліни – 54. Приклад 3 Специфічна активність засобу наступного складу, мас. %: альбумін – 2; альфа-2-глобуліни – 40; бета-гама-глобуліни – 58. складала 0,2 мг функціонально активного альфа-2-макроглобуліну на 1 мг білку, що в 6-7 разів перевищує його активність в плазмі крові людини. Таким чином, експериментально встановлено, що оптимальним є наступний склад протизапального засобу, мас. %: альбумін – 2; альфа-2глобуліни – 40; бета-гама-глобуліни – 58. Протизапальний засіб виявляє наступні переваги: використання в якості активного компоненту засобу полівалентного інгібітору плазми альфа-2макроглобуліну, який зв'язує більшість відомих протеіназ різної специфічності та каталітичних механізмів, в той час як альфа-1-антитрипсин є класоспецифічним і інактивує тільки серинові протеінази трипсиноподібної дії; біль широкий спектр терапевтичної дії завдяки тому, що поряд з антипротеіназною дією засіб виявляє протиінфекційні властивості; розширення номенклатури білкових препаратів з донорської крові, що сприятиме більш повному використанню цієї унікальної сировини. Вказаний результат досягнутий завдяки особливим властивостям даного засобу. Нами одержано новий препарат протизапальної дії на основі концентрату полівалентного інгібітору альфа-2макроглобуліна в комплексі з іншими регуляторними білками плазми крові людини, що дозволяє використовувати засіб для терапії патологій, пов'язаних з активацією протеіназ при запальних процесах. Відомо, що альфа-2-макроглобулін, який є головним активним компонентом засобу, характеризується високою антипротеіназною ємністю та унікальним механізмом інгібіторної дії. Це дозволяє йому зв'язувати протеінази всіх 4 класів: серинові, цистеінові, кислі та металозалежні, серед них головні ферменти нейтрофільних гранулоцитів еластазу, колагеназу, катепсини G, В, D, Н, що спричиняють найбільші руйнування тканинних структур та ініціюють розширення та хронізацію запальних процесів. Альфа-2-макрогло-булін також здатен нейтралізувати активність панкреатичних серинових протеіназ (трипсину, хімотрипсину, калікреїну, еластази). Причому, спорідненість до трипсину у нього в 6-8 разів вища ніж у інших інгібіторів [4]. Альфа-2-макроглобулін створює в організмі захисний барьер, знижуючи інвазійність мікроорганізмів та затримуючи розмноження вірусів [5]. Прикладом протизапальної дії засобу служить ефективність та швидкість нейтралізації серинової протеінази трипсину. Приклад 4 Трипсинзв'язуючу активність засобу визначали ензиматичним методом [6]. Встановили, що 1 г протизапального засобу за дуже короткий час (15 хв.) зв'язує від 10 до 15 мг трипсину, що перевищує даний показник плазми крові людини в 7 разів. Прикладом антивірусної активності засобу служить наступний приклад. Приклад 5 Антивірусну активність засобу досліджували на культурі клітин Hep 2. В якості модельних вірусів застосовували вакцинний штам вірусу поліомієліту Р типу та вірус везикулярного стоматиту. Залишкову інфекційність вірусів визначали шляхом їх титрування методом бляшкоутворення. 2 37445 Встановлено, що інфекційний титр вірусів в присутності протизапального засобу знижувався майже на 100 відсотків (табл.), що вказувало на здатність нейтралізувати як прості , так і складні віруси та запобігати генералізації вірусних інфекцій. Приведені приклади ілюструють, та не обмежують винахід. Таким чином, відповідно винаходу. 1. Отримано протизапальний засіб на основі полівалентного інгібітору альфа-2-макроглобуліна в комплексі з іншими регуляторними білками плазми крові людини, здатний регулювати рівень активності протеолітичних ферментів при запальних процесах, обмежуючи їх деструктивну та ініціюючу запалення дію. 2. Одержаний протизапальний засіб поряд з антиферментною виявляє антивірусну здатність, створюючи захисний бар'єр проти вірусів шляхом ефективної інгібіції їх розмноження. Джерела інформації. 1. Pat. № 5114917 US, A61К37/64 Treatment Inflammation using Alpha-1-Antichymotrypsin / J. Lezdey, A. Wachter. - Опубл. 19.05.92. - T. 1 138, № 3. 2. Coan M. N., Brockway W. J., Equizabal H. Et al. Preparation and properties of Alpha-1Proteinase Inhibitor Concentrate from Human Plasma // Vox Sang. - 1985. – 48. - № 6. - P. 333-342. 3. Wewers M. D., Casolaro M. A., Sellers S. E. et al. Replacement Therapy for Alpha-1-Antitrypsin Deficiensy associated with Emphysema // N. Engl. J. Med. - 1987. – 316. - № 17. - P. 1055-1062. 4. Borth W. Alpha-2-Macroglobulin, a multifunctional Binding Protein with targenting Characteristics // FASEB-J. - 1992. - № 6. - P. 3345-3353. 5. Shin-ichi M., Sumio S. Alpha-2-Macroglobulinlike Plasma Inactivator for Vibrio vulnificus Metalloprotease // J. Biochem. - 1991. – 110. - № 4. P. 548-552. 6. Веремеенко Л.Н., Голобородько О.П., Кизим A.M. Протеолиз в норме и при патологии. - Киев: Здоров'я, 1988. - 198 с. Таблиця Антивірусна активність протизапального засобу Назва вірусу Вихідний титр, Залишкова БУО \ мл інфекційність, Ефективність, % БУО \мл Вірус поліомієліту (штам P-712, Ch2ab) 22,25±1,00·105 7,50±0,58·102 96,68 2,00±0,95·106 4,77±0,46·103 99,76 Вірус везикулярного стоматиту (Індіана) __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 3