1,5-піперидил – 3,7-біс/діетаноламіну/ – піримідил ізовалеріанат, що використовується для діагностики вірусних інфекцій

1,5-піперидил-3,7-біс(діетаноламіну)-піримідил ізовалеріанат із загальною структурною формулою: N H що використовується для діагностики вірусних інфекцій. Винахід відноситься до ветеринарії та медицини, а конкретно - до вірусології, та може бути використаний в діагностиці вірусних інфекцій. Вірусні хвороби складають більше 90% всієї зареєстрованої інфекційної патології. В системі протиепідемічних лікувально-профілактичних заходів при вірусних захворюваннях головна роль належить лабораторній діагностиці. Тому збільшився інтерес до швидких, точних та простих вірусологічних методів, доступних для використання в практиці. Методи флуоресцентних зондів та мічених антитіл є чутливими та експресними, але речовини, що використовуються як флюорофори є нестабільними щодо світла, коштовними та токсичними. Найпоширенішим флюорофором до цього часу є флюоресцеїнізотіоцианат (ФІТЦ). Останній залишається стабільним протягом року після кон'югації з антитілами та не змінює спектр флуоресценції після взаємодії. Але цей флюорофор має ряд недоліків: нестабільність на світлі, довгий процес кон'югації, інколи ФІТЦ призводить до втрати антитілами специфічності завдяки утворенню біскон'югатів; невеликий квантовий вихід флуоресценції (до 1,2), низький коефіцієнт екстінкції. Окрім того, заряд молекули не дає утворювати різноманітні по співвідношенню кон'югати, тобто співвідношення ФІТЦ та антитіл може бути не більш ніж 3:1. При збільшенні концентрації ФІТЦ, хімічна кон'югація з Fab-частинами антитіл призводить до повної втрати специфічності. Окрім того, ФІТЦ не може бути використаний якості флуоресцентний зонд, тому що він реакційне активний завдяки ізотіоцианатній групі [1]. Серед інших речовин, що запатентовані в останній час, також знайдено багато флюорофорів [2, 3, 4, 5]. Але всі вони мають спільні недоліки: нестабільність до світла, складна багатостадійна методика кон'югації, використання коштовних компонентів (платини та ін.) для синтезу флуоресцентної мітки. Найближчим аналогом речовини, що патентується, є маркер для люмінесцентного аналізу, що представляє собою порфириновий комплекс з платиною, який має здатність до флуоресценції та кон'югований з антитілами забарвлює мішені з більшою інтенсивністю [6]. Серед недоліків цієї речовини слід виділити: зміну спектру флуоресценції при утворенні комплексу антиген-антитіло, нестабільність кон'югату щодо світла, складну технологію утворення кон'югатів та неможливість використання цієї речовини в якості флуоресцентного зонду, коштовний синтез завдяки використанню платини як компоненту синтезу, велику молекулярну масу речовини. Останній факт не дає можливості утворювати комплекси HO N N OH N A OH (13) O N 37622 Br N N (11) H O N UA N+ (19) HO 37622 порфирин-антитіло у співвідношенні, більшому ніж 1:1. В основу винаходу поставлено завдання шляхом синтезу сполуки досягти: підвищення чутливості люмінесцентного імуноаналізу; зменшення терміну затухання люмінесценції у водному розчині; збільшення чутливості методу та збільшення квантового виходу люмінесценції завдяки використанню новосинтезованої речовини групи піримідинів. Поставлена задача вирішується синтезом сполуки 1,5-піперидил-3,7-біс(діетаноламіну)-піримідил ізовалеріанату з - 1,5-піперидил-3,7-біс(діетаноламіну)-піримідину та 2-бром-ізовалеріанової кислоти, H Для підготовки тест-об'єктів клітини перещеплюванної культури вирощують у пробірках із скляними пластинами і на фазі 100% формування моношару проводять інфікування вірусами (сем. Вirnо-viridae, Coronaviridae та Herpesviridae). Після зараження клітин пробірки інкубують у термостаті протягом 30 годин при 38°С. Скляні пластини з інфікованими та інтактними клітинами через 30 годин культивування виймають з пробірок і після підсушування на повітрі (до повного висихання) фіксують охолодженим ацетоном протягом 20 хвилин. Скляні пластини з фіксованими клітинами фарбують флуоресціюючими антитілами протягом 30 хвилин у вологій камері при температурі 37°С. Після чого змивають флуоресціюючі антитіла дистильованою водою і промивають в забуференому фізіологічному розчині (рН 7,2-7,4). Після просушування тест-об'єкти досліджують в люмінесцентному мікроскопі у синьо-зеленому спектрі променів. При обліку та оцінці результатів реакції імунофлуоресценції в уражених клітинах, що містять специфічний вірусний антиген (вірус), встановлюють специфічну флуоресценцію. Яку спостерігають у вигляді яскраво-зеленого світіння специфічного антигену в цитоплазмі або в ядрі клітини (залежно від виду вірусу). Уражені клітини виявляють поодинокими або невеликими групами з кольором дифузного світіння від яскраво-зеленого до зелено-жовтого, на фоні ледве помітної архітектоніки тканини (не уражені клітини). При постановці реакції імунофлуоресценції з тест-об'єктами, що готують з інтактних клітин та з клітин інфікованих гетерологічними вірусами відносно до флуоресціюючих антитіл, спостерігають відсутність специфічного світіння - ледве профарбовані клітини, що доказує специфічність світіння. Для визначення активності флуоресціюючих антитіл проводять титрування кон'югатів на тестоб'єктах. Як тест-об'єкти використовують також перещеплювану культуру клітин, яка була вирощена на скляних пластинах в пробірках і інфікована гомологічними до флуоресціюючих імуноглобулінів вірусами. На поверхню фіксованих тестоб'єктів наносять флуоресціюючі імуноглобуліни в двократному розведенні (1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:64). В подальшому проводять РІФ, як було описано раніше. При проведені обліку та оцінці отриманих результатів РІФ визначають робочий титр кон'югатів. Таким чином, 1,5-піперидил-3,7-біс(діетаноламіну)-піримідил ізовалеріанат є маркером, який забезпечує підвищення чутливості люмінесцентного імуноаналізу, зменшує термін затухання люмінесценції у водному розчині та збільшує квантовий вихід люмінесценції. Окрім того, речовина є стабільною до світла та окислення. Відповідно, використання цієї речовини є економічно вигіднішим ніж використання ФІТЦ. Реагент буде використаний в імуноаналізі як люмінесцентний маркер антигенів та антитіл. Джерела інформації 1. Антитела. Методы: Кн. 2 / Под ред. Д. Кэтти. - М.: Мир, 1991. - С. 273-274. 2. Patent WO 92/06378. - Self-assembling fluorescent diagnostic agents. - Murashige К et al. GO1N33/53, A61K 49/00. N HO HO N N+ H O Br O N N N N N OH N OH N H що використовується для діагностики вірусних інфекцій. Синтез речовини, що патентується, проводили з - 1,5-піперидил-3,7-біс(діетаноламіну)-піримідину та 2-бром-ізовалеріанової кислоти. Приклад 1. - 1,5-піперидил-3,7-біс(діетаноламіну)-піримідил ізовалеріанат 450 мг (1 моль) 1,5-піперидил-3,7-біс(діетаноламіну)-піримідину розчиняють у 20 мл метанолу, додають 180 мг (1 моль) метанольного розчину 2-бром-ізовалеріанової кислоти, перемішують на магнітній мішалці на холоду до випадання осаду. Потім розчин залишають на добу для випадіння всього осаду. Осад відфільтровують та висушують. Електронний спектр (етанол), γ-mах, ε·10-3 нм, 380,2 (288); 510,3 (18,8); 587,5 (48). ІЧ-спектр в таблетці калію хлориду, δ, см-1: 1770 (COO-), 1215 (N=). Розраховано, %: С 43,8; H 6,08; Br 12,67; N 22,21; О 15,23. С23Н38ВгN10О6. Знайдено, %: С 43,6; H 6,11; Br 12,69; N 22,22; O 15,19. Утворення кон'югатів між флюлорофором та антитілами проводили з використанням діхлорангидриду глутарової кислоти стандартним методом [7]. Приклад 2 Для визначення специфічності світіння антитіл, з'єднаних з флюорофором проводять фарбування тест-об'єктів. Як тест-об'єкти використовують перещеплювану культуру клітин, яку інфікують специфічними та гетерологічними до флуоресціюючих антитіл вірусами, а також використовують інтактні клітини. 2 37622 3. Патент СССР; № 4413962/28-14 от 20.04.88 Способ получения флуоресцентно меченых антител. 4. Иммунологические методы исследований / Под ред. И. Лефковитса, Б. Перниса. - М.: Мир, 1988. - С. 332-334. 5. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Соловьев Б.В. и др. Методы лабораторной диагностики вирусных болезней животных. - М.: Агропромиздат, 1986. С. 177-198. 6. Патент СССР № 4813086/13 от 23.01.1992, заявка от 10.04.1990, С07D487/22, С09В47/00, G01N33/54. Маркер для люминисцентного иммуноанализа // Н.С. Осин, В.Д. Румянцева, Е.Ю. Прошина, А.Ф. Миронов. 7. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У. и др. Справочник биохимика. - М.: Мир, 1991. - 544 с. __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 3