Спосіб візуалізації структур хоріального дерева плаценти люмінесцентним методом із використанням наночастинок напівмагнітного напівпровідника

Спосіб візуалізації структур хоріального дерева плаценти люмінесцентним методом шляхом 3 37790 молекул барвника між собою, що може призводити до зменшення люмінесцентного сигналу). Нами пропонується рішення, що усуває зазначені недоліки. В основу корисної моделі поставлене завдання удосконалити спосіб ві-зуалізації структур хоріального дерева плаценти люмінесцентним методом із допомогою селективного адсорбування біосенсорної системи на базі напівпровідникової наночастинки до адсорбуючих молекул досліджуваних структур, що забезпечує підвищення точності та фотостабільності. Поставлене завдання вирішується тим, що в способі візуалізації структур хоріального дерева плаценти люмінесцентним методом шляхом реєстрації люмінесцентного сигналу від біосенсорів у тканині, згідно з корисною моделлю як біосенсор використовують синтезовані біосенсорні системи 4 наночастинка напівмагнітного напівпровідника Cd1xMn xS - меркаптоетанол, - які наносять на досліджувані зрізи тканини, після чого реєструють люмінесцентний сигнал адсорбованого біосенсора при опроміненні в діапазоні 400-440нм із селективним виявленням структур хоріального дерева плаценти. Спільними ознаками найближчого аналога та способу, що заявляється, є візуаліза-ція досліджуваних структур люмінесцентним методом. Корисна модель відрізняється від найближчого аналога тим, що джерелом люмінесцентного сигналу є наночастинки напівмагнітного напівпровідника Cd1xMn xS, які наділені функціональними перевагами, спрощується методика обробки зрізів. Порівняння способу, що заявляється, та способу-найдлижчого аналога, подано у таблиці. Таблиця Ознака Дослідження структур хоріального дерева плаценти Тип джерела люмінесцентого сигналу Характеристики люмінесцентного сигналу а) спектр збудження б) фото стабільність в) можливість регулювати емісійним спетром Спосіб люмінесцентної реєст- Спосіб люмінесцентної візуалізації структур рації бологічних об’єктів біологічних тканин (спосіб, що заявляється) (найближчий аналог) відсутнє є Органічна молекула Трьохкомпонентна напівпровідникова наночастинка вузький слабка широкий значна відсутня складом, розмірами наночастинок Теоретичне підґрунтя для використання способу. Неорганічні наночастинки є важливими складовими для утворення різноманітних функціональних надструктур. Розміри їх можуть складати від одиниць до сотень нанометрів. Вони наділені багатьма специфічними оптичними й електронними властивостями, які залежать від їх розмірів, форми, складу та мають передбачуваний характер. Розміри субклітинних стр уктур співрозмірні з розмірами наночастинок, що спонукає до використання їх як нанозондів, які дозволяють проводити дослідження на клітинному рівні. Одним із чутливи х методів дослідження біологічних об'єктів є флюо-ресцентний аналіз. Дослідження показали, що напівпровідникові квантові точки мають значні переваги над стандартними фарбуючими речовинами: збуджуються широким спектром довжин хвиль, що дозволяє при одному джерелі збудження отримувати різні спектри випромінювання; наділені значною фотостабільністю; їх спектри випромінювання, які регулюються розміром і складом наночастинок, є вузькими та симетричними; мають мінімальну інтерференцію від натуральних автофлюоресцентних частинок [Ali visatos P. The use of nanocrystals in biological detection / Nature Biotechnology. - 2004. - V.22. p.47-52, X. Michalet, F.F. Pinaud, L.A. Bentolila, J.M. Tsay, S. Doose, J.J. Li, G. Sundaresan, A.M. Wu, S.S. Gambhir, and S. Weiss Quantum Dots for Live Cells, in Vivo Imaging, and Diagnostics / Science. 2005 January 28; 307(5709): 538-544]. Використання напівпровідникових наночастинок у візуалізації біологічних об'єктів має обмеження, що пов'язано з отриманням біосумісних нанокристалів. Зокрема, різка зміна умов часто призводить до деградації та дезактивації чутливих біологічних компонентів, і обмінні реакції на поверхні наночасток часто утр уднюють формування стабільних біокон'югатів, змінюють хімічний та фізичний стан поверхневих атомів наночастинки, що в багатьох випадках зменшує квантовий вихід люмінесценції наночастинок, а також призводить до перетворень, які сприяють їх агрегації та осадженню [Christof M. Niemeyer Nanoparticles, Proteins, and Nucleic Acids: Biotechnology Meets Materials Science / Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 41284158]. Спосіб, що заявляється, здійснюється наступним чином. Метод обробки тканин перед нанесенням біосенсорів полягає у наступному. Застосований спосіб обробки тканини, який мінімально змінює її хімічні та структурні властивості, зокрема, дозволяє зберегти придатними для виявлення більшість антигенів [Эллиниди В.Н., Аникеева Н.В., Максимова Н.А. Практическая иммуногистоцитохимия (методические рекомендации). - СПб. - 2002. - 38с.] і сульфгідрильних груп білкових молекул з можливістю їх тривалої консервації у парафінових блоках. Основні принципи зазначеного способу обробки тканини полягають 5 37790 у: 1) фіксації тканини у забуференому (рН=7,0) фосфа тним буфером за Ліллі 10%-му розчині формаліну впродовж 22 годин (триваліший час обробки у формаліні призводить до артефактів структури більшості антигенів), 2) прискореному зневодненні у висхідній батареї спиртів, 3) просочуванні у парафіні при температурі 58°С (вищі значення температури можуть викликати небажані зміни структури антигенів). Гістологічні зрізи 5 мкм завтовшки отримували за допомогою санного мікротому МС-2. Нанесення біосенсорів на гістологічний зріз проводять наступним чином. Гістологічний зріз повністю покривають колоїдом із наночастинок. Тривалість експозиції в межах 5-10хв. Після експозиції гістологічний зріз промивають дистильованою водою, просушують. Фотолюмінесцентні дослідження оброблених гістологічних зрізів виконують з використанням мікроскопа ЛЮМАМ-Р-8, цифрової фотокамери Olympus C740UZ, люмінесцентного об'єктиву Л40х. Приклад практичного використання способу. З використанням способу, який заявляється як корисна модель, було проведено дослідження гістологічних препаратів плаценти людини терміном вагітності 40 тижнів. Найінтенсивніше світіння відзначалося в еритроцитах плода та матері й в інтервільозному (міжворсинчастому) фібриноїді. Дещо менш інтенсивне, але все ж чітке світіння, спостерігалося в синцитіотрофоб-ласті та ендотеліоцитах кровоносних судин хоріальних ворсин. Найменш інтенсивне світіння зафіксовано у дрібних об'єктах строми хоріальних ворсин, які з урахуванням розмірів, форми та особливостей розташування ідентифіковані як стромальні клітини (найвірогідніше, з урахуванням терміну вагітності, фібробласти). Спектральний діапазон зображення знаходився в області зеленого кольору (біля 500нм). Експерименти з цифровою фотозйомкою люмінесцентних зображень при різних витримках (за інших рівних умов експозиції) дозволили виявити, що світіння еритроцитів зумовлено світінням їх оболонки, а сприйняття того, що світи ться еритроцитарна цитоплазма, є наслідком розсіювання світла. В інтервільозному фібриноїді відзначено світіння різної інтенсивності, що особливо яскраво простежувалося у так званому каналізованому фібриноїді. Найінтенсивніше світилися ділянки, де, за імуногістохімічними даними зазвичай концентруються адгезивні молекули, зокрема, інтегрин-aХ-b2 (CD11c / CD18) [Давиденко І.С. Експресія CD11c в структура х плаценти при залізодефіцитній анемії вагітних // Буковинський медичний вісник. - 2004. - Т.8, №3-4.- С.155-158.]. Поверхня Комп’ютерна в ерстка О. Рябко 6 фібриноїду та внутрішня вистилка його поліморфних каналів, де визначалася тонка світла смужка з високою інтенсивністю світіння, яке відрізнялося за спектром від інших ділянок фібриноїду -мало жовто-золотисте забарвлення. Для усунення суб'єктивності в оцінці кольору забарвлення здійснено спектральний комп'ютерний аналіз ділянок зображення у системи RGB. Аналогічне світіння у вигляді тонкої смужки відзначалося і на поверхні синцитіотрофобласта, що також відповідає імуногіс-тохімічному розташуванню інтегрину-a-Х-b2 [Давиденко І.С. Експресія CD11c в структурах плаценти при залізодефіцитній анемії вагітних // Буковинський медичний вісник. - 2004. - Т.8, №3-4. С.155-158.]. Світіння синцитіотрофобласта було нерівномірним як за периметром кожної хоріальної ворсини, так і за глибиною трофобластичного покриву, що пояснюється коливанням концентрації різних речовин і є нормою для даної структури [Benirschke К., Kaufmann P. Baergen R.N. Pathology of the human placenta. - 5th ed. - 2006. - New York: Springer. - 1070p.]. Водночас, для всіх хоріальних ворсин відзначена закономірність, яка полягала у тому, що світіння синцитіотрофобласта завжди було сильнішим у базальних ніж апікальних відділах (за винятком самої поверхні трофобласта). Світіння ендотелію кровоносних судин хоріальних ворсин у порівнянні з синцитіотрофобластом відрізнялося більшою стабільністю по перерізу судини. Особливо чітко будову ендотелію було видно у судинах, які не містили еритроцитів. Розривів між ендотеліоцитами не виявлено. Це пояснюється тим, що вивчались плаценти з фізіологічним перебігом вагітності. Розриви між ендотеліоцитами, які з'являються при патологічному перебігу вагітності, вдасться виявити даною люмінесцентною методикою, тобто методика може бути застосована як діагностична процедура при ушкодженні ендотеліального покриву кровоносних судин. Ідентифікацію мікроскопічних структур плаценти здійснювали з урахуванням сучасних уявлень про будову хоріальних ворсин та позаворсинкових структур цього органа у термін вагітності 40 тижнів [Benirschke К., Kaufmann P. Baergen R.N. Pathology of the human placenta. - 5th ed. - 2006. New York: Springer. - 1070p.]. Для порівняння використовували гістологічний зріз плаценти із забарвленням гематоксиліном і еозином, що найчастіше використовується в гістологічній практиці. Технічний результат: використання способу, що заявляється, дозволяє здійснити морфологічну оцінку функціонального стану структур хоріального дерева плаценти та діагностувати ушкодження ендотеліального покриву кровоносних судин. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601