Спосіб експрес-визначення патогенної форми пріонового білка

Спосіб експрес-визначення патогенної форми прюнового білка, що включає обмежену протеолітичну деградацію досліджуваного зразка з по Винахід відноситься до медицини, бютехнолопі, харчової, фармацевтичної та парфумерної промисловостей та може бути використаний з метою виявлення та КІЛЬКІСНОГО визначення інфіційного агенту групи нейродегенеративних спонпформних енцефалопатій - так званої патогенної форми прюнового білка (PrPSc) [1] Відомо, ЩО нормальна клітинна форма прюс нового білка (РгР ) синезується у нервових клітинах ссавців, виводиться з клітини та підлягає швидкій деградації позаклітинними протеїназами [1] Патогенна форма прюнів відрізняється від нормальної лише за способом укладки поліпептидного ланцюгу [2] та спричиненими цією ВІДМІНОЮ фізикоХІМІЧНИМИ та біохімічними властивостями, зокрема - малою іммуногенністю, високою СТІЙКІСТЮ ДО ДІЇ денатураційних чиників та протеолітичних ферментів [3,4] Патогеній формі притаманна також висока спорідненість (адгезія) до металевої поверхні, що призвело до масового інфікування шрацеребральними внутрішньо-мозковими електродами, попередньо використаними для обстеження та лікування інфікованої людини [5,6] До нещодавно єдиний метод визначення наявності прюнової інфекції у біологічному середовищі полягав у морфологічних змінах, спричинених штрацеребральним інфікуванням лабораторних тварин, зокрема сірійських ховрахів та штучно виведених трансгенних мишей з підвищеною експресією прюнового білка [7] Подібні методи практично не придані до застосування у медичній діагностиці, бютехнологм, фармацевтичній, харчовій та парфумерній промисловостях, оскільки через дальшим визначенням сорбції патогену на афінній нерозчинній поверхні, який відрізняється тим, що наявність та КІЛЬКІСТЬ інфекційного агента визначають за адгезією протеїназостійкого білка до малоїмуногенної поверхні з показником гідрофільності - кутом змочування водою у повітряному середовищі 8 - в діапазоні від 42° до 127° С специфічний характер перебігу патології потребують великого (порядку кількох МІСЯЦІВ) інкубаційного періоду та використання великої КІЛЬКОСТІ лабораторних тварин В останні роки розроблено більш досконалі іммуноферментні методи, основані на використанні антитіл до окремих поверхневих ділянок (епітопів) патогенної форми прюнового білка [8] Як прототип вибрано іммуноферментний метод визначення наявності патогенної форми прюнового білка в екстрактах нервових тканин забитої великої рогатої худоби [9] Спосіб-прототип полягає в обмеженій протеолітичній деградації досліджуваного матеріалу протеолітичними ферментами серинового ряду з подальшим сендвічним іммуноферментним визначенням стабільного до протеолітичної деградації домена патогенного прюнового білка (PrPres) за допомогою ферментзв'язаного іммуносорбенту (ELISA) [9] Недоліки способу-прототипу полягають в обмеженій придатності до практичного застосування через складність виконання, високу ціну та лабільність імунних та фермент-ассоційованих препаратів, а також у принциповій непридатності до виявлення прюнових форм, ВІДМІННИХ від заданої видової форми прюнового білка [10] Задача винаходу полягає в розробці придатного до масового практичного використання способу експрес-визначення патогенної форми прюнового білка Поставлена задача досягнута завдяки комплексному використанню відомих та притаманних всім без винятку видам патогенної форми прюнового (О 47699 білка властивостей - відносно великої СТІЙКОСТІ ДО дії протеолітичних ферментів та високої адгезії до гідрофобних поверхностей як наслідку формус вання характерної конформації РгР внаслідок взаємодії неструктурованої білкової молекули з подвійним гідрофобним шаром клітинних мембран (так званого мембранного фолдингу [11]) Досліджуваний зразок піддають обмеженій протеолітичній деградації, після чого проводять визначення сорбції на гідрофобній поверхні датчика мономолекулярного шару протеїназостійких білків Одним з найпростіших видів апаратного оформлення реєстрації сорбції білкового моношару на поверхні датчика є застосування методу плазмонного резонансу [12, 13] СПІЛЬНІ риси способу-прототипу та способу, що заявляється, полягають у попередній обмеженій протеолітичній деградації досліджуваних зразків з подальшим визначенням сорбції протеїназостійкого інфекційного агенту на афінній нерозчинній поверхні На відміну від способу-прототипу, що полягає в реєстрації зв'язування протеїназостабільного домена патогенної форми прюнового білка (PrPres) після обмеженої деградації досліджуваного біологічного матеріалу сериновими протеїназами, запропонований спосіб базується на притаманній патогенній формі прюнового білка високій спорідненості (адгезії) до гідрофобних (зокрема - металевих) поверхней, не вимагає дорогих та лабільних іммуноферментних препаратів та не має принципової обмеженості щодо видового походження прюнового білка Спосіб визначається ВІДПОВІДНО ДО наведених прикладів Приклад 1 Спектроскопічне обладнання Спектрометр поверхневого плазмонного резонансу (ППР) BioSulparTa сенсорні платівки з напиленим шаром полікристалічного металу було виготовлено в Інституті фізики напівпровідників НАН України Попередню пасивацію металевої поверхні сенсорних платівок проводили в Інституті біохімії НАН України Приклад 2 Інфекційний матеріал Гомогенат головного мозку інфікованих BSEпозитивних мишей готували згідно [9] в 0 5 М розчині хлориду натрію в 0 05 М трис-солянокислому буфері, що містив 0 01 М хлориду кальцію, рН 7 4 за співвідношення 1 5 (вага об'єм) Відокремлювали супернант центрифугуванням при 3000 g протягом 20 хвилин, після чого проводили обмежений гидроліз протеїназою К з подальшим розведенням зразків тим же буфером В якості контролю використовували аналогічним чином приготовані препарати з головного мозку неінфікованих мишей Приклад 3 Спектроскопічне визначення сорбції білкового моношару Спектроскопічне визначення проводили згідно [14] за кімнатної температури та ПОСТІЙНІЙ ШВИДКО СТІ протікання досліджуваної та промивної рідин через кювету ППР-спектрометра Спостерігали надійну реєстрацію сорбції білкового моношару за умов проходження через кювету 0 2мл зразка у розведеннні 1 3000 Збільшення досліджуваного об'єму до 1 2мл забезпечувало надійну реєстрацію за 12000-ного розведення Препарати з неінфікованої сировини зміни ІИ IP-сигналу не викликали за будь-яких розведень З наведених прикладів витікає, що за чутливістю до прюнової інфекції розроблений спосіб не поступається іммуноферментному методу [9], перевершуючи останній простотою виконання, нечутливістю до видового типу прюнової інфекції, відсутністю потреби в дорогих та лабільних препаратах та здатністю до реєстрації найменших кількосс тей РгР завдяки можливості збільшення об'єму досліджуваної проби Тим самим розроблено придатний до практичного застосування спрощений експрес-метод визначення патогенної форми прюнового білка, що може бути використаній у медичній діагностиці, біотехнологм, фармацевтичній, харчовій та парфумерній промисловостях Список посилань 1 Prusmer S Molecular biology of pnon disease //Science -1991, 14 June - 252-P 1515 -1522 2 Pan К, Baldwin M , Nguyen J et al Conversion of a-hehces into p-sheets features in the formation of the scrapie pnon protein // Proc Natl Acad Sci USA - 1993 - 90, N 23 - P 10962-10966 3 McKmley M , Bolton D , Prusmer S A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie pnon//Cell -1983 - 35, N 1 -P 57-62 4 Kocisco D , Come J , Pnola S et al Cell-free formation of protemase-resistant pnon protein // Nature -1994 -370 -P471 -474 5 Brown P , Preece M , Will R "Friendly fire" in medicine hormones, homograits, and CreutzfeldtJakob disease // Lancet, - 1992 - 340, N 8810 -P 24 -27 6 Bernoulli С , Siegfried J , Baumgartner G , et al Danger of accidental person to person transmission of Creutzfeldt-Jakob disease by surgery //Lancet -1977 -1, N8009-P 478 - 479 7 European Comission in Oral Exposure of Humans to the BSE Agent Infective Dose and Species Baner - Scientific Steering Committee Meeting, 13-14 April 2000 8 Moynagh J , Schimmel H Tests for BSE evaluated // Nature -1999, 8 July -P 105 9 Deslys J , Comoy E, Hawkins S et al Screening slaughtered cattle for BSE // Nature 2001,25 January - 409 - P 476 - 478 10 Verevka S Pnons and protein inhibitors of protemases structural analogies and their consequences III Additive risk factor in transgemc technologies// Укр биохим журн - 2001 - 73, N 1 C153-1154 11 Веревка С Прионы и серпины структурные аналогии и их следствия I Протеиназотранспортная гипотеза // Укр биохим журн - 1999 -71, N 5 -С 135-139 12 Schuck Р // Annu Rev Biophys Biomol Stract -1997 - 26, N - P 541 - 566 13 LofasS //Pure and Appl Chem -1995 -67, N -P 829 -834 14 Snopok В , Kostyukevich К , Bekrtov G et al Biochemical passivation of metal surfaces for sensor 5 47699 application reactive annealing of polycrystallme gold films in hydrogen sulfide atmosphere // Semiconduc 6 tor Physics, Quantum Electronics & Optoelectronics 2000 - 3, N 1 - P 59 - 68 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044) 456 - 20 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71