Спосіб зниження холодового шоку еритроцитів людини

Спосіб зниження холодового шоку еритроцитів людини, що включає інкубацію еритроцитів у гіпертонічному розчині при 37 °С протягом 10 хв. і інкубацію при 0 °С у присутності антигемолітичної речовини протягом 10 хв., який відрізняється тим, що після інкубації в гіпертонічному розчині при 37 °С еритроцити переносять в охолоджений до 0 °С гіпертонічний розчин, в який заздалегідь вносять антигемолітичну речовину, причому як антигемолітичну речовину використовують речовину амфіфільної природи. (19) (21) u200810779 (22) 01.09.2008 (24) 26.01.2009 (46) 26.01.2009, Бюл.№ 2, 2009 р. (72) ШПАКОВА Н АТАЛІЯ МИ ХАЙЛІВН А, U A, ОРЛОВА Н АТАЛІЯ ВІКТОРІВН А, U A, БОНДАРЕНКО ВАЛЕРІЙ АНТОНОВИЧ, U A (73) ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ Н АУК УКРАЇНИ, U A 3 38944 4 людини, що включає інкубацію еритроцитів у гіфугують і визначають рівень гемолізу, який свідчить про рівень пошкодження клітин при холодопертонічному розчині при 37°С протягом 10хв. і вому шоці еритроцитів. інкубацію при 0°С у присутності антигемолітичної Приклад 1. речовини протягом 10хв., згідно з корисною моЕритроцити донорської крові тричі відмивали деллю, після інкубації в гіпертонічному розчині при фізіологічним розчином (150мМ NaCl, 5мМ фос37°С еритроцити переносять в охолоджений до фатний буфер, рН 7,4) від плазми і формених 0°С гіпертонічний розчин, в який заздалегідь вноелементів шляхом центрифугування при g=1500 сять антигемолітичну речовину, причому як антипротягом 3хв. і зберігали у вигляді осаду при 0°С гемолітичну речовину використовують речовину не більш 2 годин. амфіфільної природи. Еритроцити (50мкл) додавали до 1мл гіпертоМолекули амфіфільних сполук мають гідрофінічного розчину, що містить 1,2 М NaCl, і інкубувальну і гідрофобну частини. Ці амфіфільні речовини ли при 37°С протягом 10хв. Потім аліквоту (50мкл) (згідно загальноприйнятої класифікації) є предстапереносили на 10хв. в охолоджений до 0°С гіпервниками 2 класів: катіонні (хлорпромазин, трифтотонічний розчин, в який заздалегідь вносили амрперазин) і аніонні (децилсульфат натрію). Баланс фіфільну речовину хлорпромазин із розрахунку гідрофільності-гідрофобності молекул визначає їх 10мкл до 1мл розчину (кінцевий гематокрит 0,4%). здатність вбудовуватися і розподілятися в мемКінцева концентрація хлорпромазину в гіпертонічбрані, викликати трансформацію клітин за типом ному розчині складала 120мкМ. Контролем були дискоцит-стоматоцит або дискоцит-з-хіноцит і заеритроцити, перенесені на 10хв. у розчин 1,2 NaCl побігати появі трансмембранної гемолітичної пори. Амфі фільні речовини знижують рівень холодового при 37°С, а потім на 10хв. у гіпертонічне середошоку при використанні в мікромолярних концентвище, що не мало хлорпромазину, при 0°С. Після раціях, що нижче в порівнянні з концентрацією центрифугування кількість гемоглобіну в надосаді діаміду, яка використовується в прототипі, на 2-3 визначали спектрофотометрично при довжині порядки. хвилі 543нм і виражали у відсотках по відношенню При використанні амфіфільних речовин не подо 100% гемолізу еритроцитів у присутності детертрібний етап попередньої інкубації еритроцитів із гента тритона Х-100 (кінцева концентрація 0,1%). антигемолітичною речовиною з подальшим 3Рівень холодового шоку еритроцитів людини кратним центрифугуванням, що спрощує спосіб і складав 85%, у присутності хлорпромазину - 30%. скорочує час його здійснення приблизно в 5 разів. Приклад 2. Окрім цього використання амфіфільних речовин Спосіб здійснювали аналогічно прикладу 1, за запобігає утворенню внутрішньо- і міжбілкових винятком того, що як антигемолітичну речовину зшивань в еритроцитах. використовували трифторперазин у кінцевій конСпосіб здійснюють таким чином. центрації 60мкМ. Амфі фільну речовину, приготовану на фізіолоПриклад 3. гічному розчині, додають у кількості 10мкл до 1мл Спосіб здійснювали аналогічно прикладу 1, за гіпертонічного розчину, що містить 1,2 М NaCl і винятком того, що як антигемолітичну речовину має температуру 0°С. Еритроцити, тричі відмиті використовували децилсульфат натрію у кінцевій фізіологічним розчином, додають до гіпертонічного концентрації 47мкМ. середовища (1,2 М NaCl) із температурою 37°С і Результати, отримані при здійсненні способу інкубують протягом 10хв. Потім аліквоту (50мкл) з згідно з прикладами 1-3, наведені в Таблиці. З вказаного розчину переносять у гіпертонічне середаних Таблиці видно, що у присутності амфіфільдовище, що містить 1,2 М NaCl, амфіфільну речоних речовин рівень холодового шоку знижується у вину і має температуру 0°С (кінцевий гематокрит порівнянні з контролем в 2,1-8,5 рази. 0,4%). Після 10хв. інкубації при 0°С проби центриТаблиця Рівень холодового шоку еритроцитів людини в гіпертонічному середовищі Речовина контроль хлорпромазин трифторперазин децилсульфат натрію контроль (за прототипом) діамід (за прототипом) Концентрація, мкМ 0 120 60 47 0 5000 Примітка: А - гемоліз контрольних еритроцитів, Б - гемоліз еритроцитів у присутності анті гемолітичної речовини. Джерела інформації: 1. Minetti М, Сессагіпі М, Di Stasi A.M.M. Role of membrane thermotropic properties on hypotonic hemolysis and hypertonic cryohemolysis of human Гемоліз, % 85±7 30±5 10±4 40±7 51 23 А/Б 2,8 8,5 2,1 2,2 red blood cells // J. Cell. Biochem.- 1984. - 25, №2. P.61-72. 2. Рамазанов В. В., Бондаренко В. А. Действие гемина и ДИДС на холодовой и гипертонический шок эритроцитов // Пробл. криобиологии. - 1996. №2. - С.13-17. 5 38944 6 3. Green F. A., Jung C. Y., Cuppoletti J., Owens oxidizing agents// Biochim. Biophys. Acta. - 1977. N. Hypertonic cryohemolysis and cytoskeletal sys469. - P.226-230. tem// Biochim. Biophys. Acta. - 1981. - 648, №2. 5. Maeda N., Kon K., Imaizumi K., Sekiya M., P.225-230. Shiga T. Alteration of rheological properties of human 4. Haest С, Kamp D., Plasa G., Deuticke B. Intraerythrocytes by crosslinking of membrane proteins and intermolecular cross-linking of membrane pro//Biochim Biophys Acta. - 1983. - 735, №1. - P.104teins in intact erythrocytes and ghosts by SH12. Комп’ютерна в ерстка А. Крижанівський Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601