Спосіб одержання екзополісахариду

Спосіб одержання екзополісахариду, що включає культивування Acinetobacter sp. ІMB В7005 на поживному середовищі, що містить мінеральні солі, ростові фактори і як джерело вуглецевого живлення суміш етанолу і меляси, який відрізняється тим, що змішаний субстрат містить нейтралізовану після кислотної обробки мелясу. (19) (21) u200811451 (22) 23.09.2008 (24) 25.02.2009 (46) 25.02.2009, Бюл.№ 4, 2009 р. (72) ПИРОГ ТЕТЯНА ПАВЛІВН А, UA, ІВАНУШКІНА ГАННА ОЛЕКСАНДРІВН А, UA (73) НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ, UA 3 39399 гідролізу сахарози, здійснюють так: до 100г меляси додають дистильовану воду до кінцевого об'єму 200мл, в отриманий розчин вносять 20мл 1 н H2SO4, після чого стерилізують при температурі 112°С упродовж 30хв. Після охолодження розчин меляси нейтралізують 10%-ним КОН. Як посівний матеріал використовують культур у з експоненційної фази росту (20-24год.), вирощену на мінеральному середовищі наведеного вище складу, що містить 0,5% (об'ємна частка) етанолу як джерело вуглецевого живлення. Кількість посівного матеріалу становить 10%. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750мл з 100мл середовища на качалці (220об/хв.) при 30°С, рН 6,8-7,0 упродовж 96год. Використання нового способу дає змогу знизити у середовищі культивування продуцента екзополісахариду вміст мінеральних солей з 9,1 до 3,7г/л і підвищити кількість екзополісахариду з 9,2 до 11,2г/л. Приклад 1. Синтез екзополісахариду Acinetobacter sp. ІMB В-7005 на середовищах з різним вмістом солей. Культивування бактерій здійснюють на мінеральних середовищах такого складу (г/л), середовище 1: КН2РО4-6,8; КОН-1,8; MgSO 4´7Н2О-0,4; СаСl2´2Н2О-0,1; FeSO4´7Н2 О-0,001; середовище 2: КН2РО-3,2; MgSO 4´7Н2 О-0,4; СаСl2´2Н2О-0,1; FeSO4´7H2 O-0,001. У середовища додатково вносять 0,5% (об'ємна частка) дріжджового автолізату та 0,0006% (масова частка) пантотенату кальцію. Як джерело вуглецю і енергії використовують су 4 міш етанолу (0,75%, об'ємна частка) і меляси (0,75% за вуглеводами, масова частка). Кислотну обробку меляси здійснюють як описано вище. Як посівний матеріал використовують культур у з експоненційної фази росту (20-24год.), вирощену на мінеральному середовищі наведеного вище складу, що містить 0,5% (об'ємна частка) етанолу як джерело вуглецевого живлення. Кількість посівного матеріалу становить 10%. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750мл з 100мл середовища на качалці (220об/хв.) при 30°С, рН 6,8-7,0 упродовж 96год. Концентрацію біомаси визначають за оптичною густиною клітинної суспензії з наступним перерахунком на абсолютно суху біомасу клітин (АСБ) у відповідності з калібрувальним графіком. Ефективність трансформації вуглецю субстратів в ЕПС оцінюють за такими показниками: кількість синтезованих ЕПС і ЕПС-синтезувальна здатність. Кількість синтезованого екзополісахариду встановлюють ваговим методом. ЕПС-синтезувальну здатність розраховують як відношення кількості синтезованого ЕПС до біомаси та виражають у г ЕПС/г АСБ. Як видно з наведених у табл.1 даних, при вирощуванні продуцента на середовищі 2 із зниженим вмістом солей показники синтезу ЕПС суттєво знижуються. При цьому рН культуральної рідини до кінця культивування на середовищі 2 становить 5,7, що є неоптимальним для синтезу даного екзополісахариду. Таблиця 1 Синтез екзополісахариду на суміші етанолу і меляси на середовищах з різним вмістом солей Середовище культивування 1 (прототип) 2 АСБ, г/л ЕПС, г/л 2,5 1,7 9,2 4,2 Вище значення рН культуральної рідини після вирощування продуцента на середовищі 1 зумовлене, очевидно, вищою молярністю буфер у цього середовища (0,05М проти 0,02М для середовища 2). Цілком ймовірно, що внесення у незабуферене середовище 2 «кислої» меляси супроводжується зниженням рН середовища до рівня, при якому сповільнюється споживання субстратів штамом В7005. Приклад 2. Вплив рН на швидкість окиснення етанолу і меляси інтактними клітинами Acinetobacter sp. ІMB В-7005. Культивування бактерій здійснюють на середовищі 1 в умовах, описаних вище, до середини експоненційної фази росту. Для визначення швидкості окиснення субстрату клітини Acinetobacter sp. ЕПС-синтезувальна здатність, г ЕПС/г АСБ 3,7 2,5 рН (кінцеве) 6,7 5,7 В-7005 центрифугують (4000g, 15хв., 4°С). Отриманий осад клітин двічі відмивають від залишків середовища 0,05М К+-фосфатним буфером (рН 7,0) центрифугуючи (4000g, 15хв., 4°С). Відмиті клітини ресуспендують у 0,05М К+-фосфатному буфері (рН 7,0). Для інкубації клітин при визначенні швидкості окиснення субстратів використовують трис-НСl буфер (0,05М, рН 7,0). Швидкість окиснення етанолу і меляси (10мМ) встановлюють за швидкістю поглинання кисню у реакційній суміші полярографічним методом за допомогою електроду закритого типу на полярографі ППТ-1 при температурі 28-30°С. Як видно з наведених у табл.2 даних, швидкість окиснення субстратів при рН 6,0 і нижче сповільнюється. 5 39399 6 Таблиця 2 Швидкість окислення ацетату інтактними клітинами Acinetobacter sp. ІМВ В-7005 за різних значень pH Швидкість окиснення (нмоль O2×хв.-1 мг-1 клітин) етанолу меляси 8,2 4,3 45,3 38,1 97,9 89,5 pH реакційної суміші 5,0 6,0 7,0 Приклад 3. Вплив способу обробки меляси на синтез екзополісахариду Acinetobacter sp. ІMB В7005. Культивування бактерій здійснюють в умовах, описаних вище. Як ростовий субстрат використовують «кислу» і нейтралізовану після кислотної обробки мелясу. Нейтралізацію розчину меляси здійснюють 10%-ним розчином КОН. Як видно з наведених у табл.3 даних, показники синтезу ЕПС на середовищі 2 з нейтралізованою мелясою були вищими, ніж згідно прототипу. Таблиця 3 Синтез екзополісахариду на залежно від способу обробки меляси Середовище культивування 1 (прототип) 2 2 Джерело вуглецю ЕПС, г/л Етанол+меляса (без нейтралізації) Етанол+меляса (без нейтралізації) Етанол+меляса (нейтралізована) 9,2 4,2 11,2 Таким чином, використання як ростового субстрату нейтралізованої після кислотної обробки меляси дає змогу підвищити на 20% кількість синтезованого Acinetobacter sp. ІMB В-7005 екзополі Комп’ютерна в ерстка C.Литв иненко ЕПС-синтезувальна здатність, г ЕПС/г АСБ 3,7 2,5 4,55 рН (кінцеве) 6,7 5,7 6,7 сахариду (до 11,2г/л) і здійснити процес його одержання на середовищі з етанолом і мелясою, в якому вміст солей знижено з 9,1 до 3,7г/л. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601