Спосіб одержання полісахариду

Спосіб одержання полісахариду, що передбачає культивування Acinetobacter sp. ІMB В-7005 і синтез полісахариду на поживному середовищі, що містить джерело вуглецевого живлення, мінеральні солі і ростові фактори, який відрізняється тим, що як джерело вуглецевого живлення використовують суміш етанолу і глюкози у молярному співвідношенні 3,1:1 відповідно. (19) (21) u200602566 (22) 09.03.2006 (24) 15.12.2006 (46) 15.12.2006, Бюл. № 12, 2006 р. (72) Пирог Тетяна Павлівна, Висятецька Надія Володимирівна (73) НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ 3 19138 середовища на качалці (220об/хв) при 30°С, рН 6,8-7,0 упродовж 120 год. Використання нового способу дає змогу підвищити кількість синтезованого Acinetobacter sp. IMB В-7005 полісахариду майже у два рази (до 7,2г/л). Приклад 1. Теоретичний розрахунок оптимального співвідношення концентрацій двох енергетично нерівноцінних ростових субстратів у середовищі культивування Acinetobacter sp. IMB В-7005. Полісахарид Acinetobacter sp. ІMB В-7005 складається з нейтрального і двох кислих компонентів, один з який ацильований. Ацильований (АП) і неацильований (НАП) полісахариди ідентичні за молярним співвідношенням D-глюкози, Dманози, D-галактози, L-рамнози, D-глюкуронової і піровиноградної кислот (3:2:1:1:1:1) та структурою повторюваної одиниці вуглеводного ланцюга. Різниця між цими ЕПС полягає в тому, що ацильований полісахарид вміщує жирні кислоти (C12-C18). При розрахунку співвідношення концентрацій 4 етанолу та глюкози нами були прийняті такі припущення: 1) етанол головним чином використовується як джерело енергії, на синтез біомаси та ЕПС витрачається вуглець глюкози; 2) 50% глюкози катаболізується за шляхом гліколізу і 50% - за шляхом Ентнера-Дудорова (КДФГ-шлях); 3) співвідношення Р/О дорівнює 2; 4) полісахарид містить 50% ацильованого полісахариду та 50% неацильованого полісахариду; 5) у складі повторюваної ланки АП міститься два залишки жирних кислот - лауринової (С12Н24О2) і пальмітинової (С16Н32О2); 6) НАДФН, що утворюється при катаболізмі етанолу та глюкози, є джерелом відновлювальних еквівалентів, які окиснюються до води через дихальний ланцюг. При утворенні ЕПС енергія витрачається на синтез моносахаридів і жирних кислот, а генерується під час синтезу ПВК, глюкуронової кислоти та ацетил-КоА. Енергетичні потреби мікробного синтезу АП і НАП у перерахунку на моль використаної глюкози представлені в табл. 1. Таблиця 1 Енергетичні потреби синтезу ацильованого та неацильованого полісахаридів штамом Acinetobacter sp. ІMB В-7005 з глюкози Шлях катаболізму глюкози Гліколіз КДФГ-шлях ЕПС АП НАП АП+НАП АП НАП АП+НАП Витрата енергії, моль АТФ Витрата глюкози на синтез ланки На синтез На моль викорисЕПС, моль ланки ЕПС таної глюкози 15,5 8,5 24 15,5 8,5 24 29 17 46 29 17 46 Таким чином, генерація енергії при синтезі ЕПС з глюкози складає 1,42 моль АТФ/моль використаної глюкози (табл. 1). Синтез біомаси з фосфогліцеринової кислоти (ФГК) при використанні амонійного джерела азоту можна представити у вигляді рівняння: 4ФГК+NH3+29АТФ+5,5 НАД(Ф)Н→(С4H8O2N1)3, (1) де (С4H8O2N1)3 - формула моля біомаси. Сумарні реакції перетворення етанолу та глюкози в ФГК відображаються наступними рівняннями: 2C2H5ОH+3АТФ→ФГК+6НАД(Ф)Н+ФАДН2+CО2 (2) С6Н12О6→2 ФГК+2 НАД(Ф)Н (гліколіз) (3) С6Н12О6+2 АТФ→2ФГК+2НАД(Ф)Н (КДФГ-шлях) (4) З наведених вище рівнянь можна розрахувати, що при рості на глюкозі потреба в АТФ для синтезу біомаси (в розрахунку на моль глюкози) становить 17 молей. Джерелом цієї енергії може бути етанол. Враховуючи, що при синтезі ЕПС з глюкози генерується 1,42 моль АТФ/моль використаної глюкози, за рахунок етанолу повинно бути отримано 17-1,42=15,58 моль АТФ. З рівняння перетворення етанолу в ФГК виходить, що для одержання такої кількості АТФ необхідно 3,1 моль етанолу. Отже, молярне співвідношення етанолу та глюкози в середовищі повинно складати 3,1:1, 1,87 2 1,92 1,87 2,0 1,92 Генерація енергії, моль АТФ На моль виНа синтез користаної ланки ЕПС глюкози 77 4,97 7 0,12 84 3,5 69,5 4,48 6,5 0,76 76 3,17 тобто при концентрації глюкози в середовищі 1% (масова частка) концентрація етанолу повинна становити 1% за об'ємом). Приклад 2. Синтез полісахариду при культивуванні Acinetobacter sp. ІMB В-7005 на суміші енергетично нерівноцінних ростових субстратів. Культивування бактерій здійснювали в умовах, описаних вище. Як джерело вуглецю і енергії використовують моносубстрати: етанол в концентрації 1,0 і 1,5% (за об'ємом) і глюкозу в концентрації 1,0 і 1,5% (масова частка), а також суміш цих субстратів у співвідношенні 2:1, 1:1, 1:2 (% етанолу: % глюкози), що відповідає молярному співвідношенню 6,2:1; 3,1:1; 1,55:1. Концентрацію біомаси визначають за оптичною густиною клітинної суспензії з наступним перерахунком на абсолютносуху біомасу клітин (АСБ) у відповідності з калібрувальним графіком. Ефективність трансформації вуглецю субстратів в ЕПС оцінюють за наступними показниками: кількість синтезованих ЕПС, вихід ЕПС від субстрату, ЕПС-синтезувальна здатність. Кількість синтезованого полісахариду встановлюють ваговим методом. ЕПС-синтезувальну здатність розраховують як відношення кількості синтезованого ЕПС до біомаси та виражають у г ЕПС/ г АСБ. 5 19138 Концентрацію етанолу в культуральній рідині визначають за методом газорідинної хроматографії, глюкози - за глюкозооксидазним методом. 6 Показники синтезу полісахариду на основі моно- і змішаних С2-С6-субстратів наведено у табл. 2. Таблиця 2 Утворення полісахариду при вирощуванні Acinetobacter sp. ІMB В-7005 на суміші етанолу та глюкози Джерело вуглецю Біомаса, г/л ЕПС, г/л 1,9 1,5 1,8 1,7 1,5 1,8 1,3 1.5 7,2 5,6 4,2 5,1 3,2 3,8 3,6 4,0 Етанол 0,75% + глюкоза 0,75% Етанол 0,5% + глюкоза 0,5% Етанол 1%+ глюкоза 0,5% Етанол 0,5% + глюкоза 1,0% Етанол 1,0% Етанол 1,5% (прототип) Глюкоза 1,0% Глюкоза 1,5% З даних табл. 2 видно, що при культивуванні продуцента на суміші субстратів кількість синтезованого полісахариду є вищою, ніж на моносубстратах. Але тільки при теоретично розрахованому співвідношенні концентрацій цих субстратів спостерігається суттєве збільшення не тільки кількості Комп’ютерна верстка А. Крулевський Показники процесу ЕПС-синтезувальна здатність, г ЕПС/ г біомаси 3,79 3,73 2,33 3.0 2,13 2,11 2,77 2,67 Вихід ЕПС від субстрату, % 53,3 62,2 32,3 36,4 40,0 31,7 36,0 26,7 синтезованого ЕПС, але й його виходу по відношенню до біомаси та субстрату. Порівняно з найближчим аналогом кількість синтезованого полісахариду збільшується майже у два рази (3,8 і 7,2г/л відповідно). Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601