Спосіб одержання полісахариду

Спосіб одержання полісахариду, що включає періодичне культивування Acinetobacter sp. IMB В 3 33173 MgSO4 x 7Н2О - 0,4; СаСl2 х 2Н2О - 0,1; FeSО4 x 7H2O - 0,001. У середовище додатково вносять 0,5% (об'ємна частка) дріжджового автолізату та 0,0006% (масова частка) пантотенату кальцію. Як джерело вуглецю і енергії використовують суміш етанолу (0,75%, об'ємна частка) і меляси (0,75% за вуглеводами, масова частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (20-24год), вирощену на мінеральному середовищі наведеного вище складу, що містить 0,5% (об'ємна частка) етанолу як джерело вуглецевого живлення. Кількість посівного матеріалу становить 10%. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750мл з 100мл середовища на качалці (220об/хв.) при 30°С, рН 6,8-7,0 упродовж 96год. Використання нового способу дає змогу скоротити тривалість процесу культивування продуцента полісахариду зі 120 до 96год, а також виключити з середовища джерело мінерального азоту. Приклад 1. Вплив способу підготовки меляси на синтез полісахариду Acinetobacter sp. IMB В7005 Культивування бактерій здійснюють на мінеральному середовищі такого складу (г/л) : КН2РО4 - 6,8; КОН -1,8; NH4NO3 - 0,3; MgSO4 х 7Н2О - 0,4; СаСl2 х 2Н2О - 0,1; FeSO4 х 7Н2О - 0,001. У середовище додатково вносять 0,5% (об'ємна частка) дріжджового автолізату. Як джерело вуглецю і енергії використовують глюкозу, фруктозу і сахарозу у концентрації 1% (масова частка), а також гідролізовану і негідролізовану мелясу у концентрації 1 і 2% за вуглеводами (масова частка). Гідроліз меляси здійснюють так: до 100г меляси до 4 дають дистильовану воду до кінцевого об'єму 200мл, в отриманий розчин вносять 20мл 1н H2SO4, після чого стерилізують при температурі 112°С упродовж 30хв. Як посівний матеріал використовують добову культуру, вирощену на МПА. Концентрацію біомаси визначають за оптичною густиною клітинної суспензії з наступним перерахунком на абсолютно суху біомасу клітин (АСБ) у відповідності з калібрувальним графіком. Ефективність трансформації вуглецю субстратів в ЕПС оцінюють за такими показниками: кількість синтезованих ЕПС і ЕПС-синтезувальна здатність. Кількість синтезованого полісахариду встановлюють ваговим методом. ЕПС-синтезувальну здатність розраховують як відношення кількості синтезованого ЕПС до біомаси та виражають у г ЕПС/ г АСБ. Як видно з наведених у табл.1 даних, при вирощуванні продуцента етаполану на середовищі з моносахаридами (глюкоза, фруктоза) рівень біомаси і ЕПС є більш, ніж удвічі вищим порівняно з культивуванням штаму на сахарозі. Очевидно, це зумовлено невисокою активністю у бактерій ферментних систем, що здійснюють гідроліз сахарози. Ці результати можуть свідчити про необхідність попереднього гідролізу меляси при використанні її як джерела вуглецевого живлення для одержання полісахариду. Дійсно, при вирощуванні Acinetobacter sp. В-7005 на середовищі з гідролізованою мелясою показники синтезу ЕПС були значно вищими, ніж на середовищі з мелясою негідролізованою (табл.1). Таблиця 1 Вплив джерела вуглецю на ріст Acinetobacter sp. B-7005 і синтез полісахариду Показники процесу Джерело вуглецю Сахароза Глюкоза Фруктоза Концентрація джерела вуглецю, % 1,0 1,0 1,0 1,0 Меляса негідролізована 2,0 1,0 Меляса гідролізована 2,0 Приклад 2. Залежність синтезу полісахариду на суміші етанолу і меляси від наявності у середовищі джерела мінерального азоту Культивування бактерій здійснюють на мінеральному середовищі 1 такого складу (г/л) : КН2РО4 - 6,8; КОН -1,8; NH4 NO3 - 0,3; MgSO4 х 7Н2О - 0,4; СаСl2 х 2Н2О - 0,1; FeSO4 x 7H2O 0,001, а також на середовищі 2, яке відрізняється від середовища 1 тим, що не містить NH4NO3. У середовища додатково вносять 0,5% (об'ємна частка) дріжджового автолізату та 0,0006% (масова частка) пантотенату кальцію. Як джерело вуглецю ЕПС, г/л АСБ, г/л 0,35 0,85 0,85 0,95 ЕПС-синтезувальна здатність, г ЕПС/ г АСБ 0,90 2,25 2,30 1,50 2,57 2,65 2,71 1,58 1,40 2,95 2,11 1,60 3,80 2,37 2,80 5,80 2,07 і енергії використовують суміш етанолу (0,5 і 0,75%, об'ємна частка) і гідролізованої меляси (0,5 і 0,75%, масова частка за вуглеводами). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (20-24год.), вирощену на мінеральному середовищі 1, що містить як джерело вуглецевого живлення етанол (0,5%, об'ємна частка). Кількість посівного матеріалу становить 10% від об'єму середовища. Тривалість культивування 120год. Показники синтезу полісахариду наведено у табл.2. 5 33173 6 Таблиця 2 Вплив концентрації джерела мінерального азоту у середовищі на синтез полісахариду на суміші етанолу і меляси Джерело вуглецю в се- Концентрація NH4 NO3, редовищі культивування г/л Етанол, 0,5% + меляса, 0,5% Етанол, 0,75% + меляса, 0,75% рНкін 6,6 0,3 Показники процесу ЕПС- синтезувальна АСБ, г/л ЕПС, г/л здатність, г ЕПС / г АСБ 1,9 6,6 3,5 6,7 6,6 4,4 2,5 9,2 3,7 6,7 0 1,5 6,4 0 0,3 2,5 9,2 3,7 Отже, показники синтезу полісахариду на суміші етанолу і меляси є однаковими незалежно від наявності у середовищі джерела мінерального азоту (нітрату амонію). Оскільки меляса містить 1,8% азоту, то очевидно, тієї кількості азоту, що вноситься у середовище з мелясою, достатньо для росту бактерій. Приклад 3. Вплив тривалості культивування на синтезу полісахариду Культивування бактерій здійснюють на мінеральному середовищі такого складу (г/л) : КН2РО4 - 6,8; КОН -1,8; MgSO4 х 7Н2О - 0,4; СаСl2 х 2Н2О - 0,1; FeSO4 x7H2O - 0,001. У середовища додатково вносять 0,5% (об'ємна частка) дріжджового автолізату та 0,0006% (масова частка) пантотенату кальцію. Як джерело вуглецю і енергії використовують суміш етанолу (0,75%, об'ємна частка) і гідролізованої меляси (0,75%, масова частка за вуглеводами), а також суміш етанолу (0,75%, об'ємна частка) і глюкози (0,75%, масова частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (2024год.), вирощену на середовищі наведеного вище складу, що містить як джерело вуглецевого живлення етанол (0,5%, об'ємна частка). Кількість посівного матеріалу становить 10% від об'єму середовища. Тривалість культивування становить 96 і 120год. Як видно з даних, наведених у табл.3, кількість синтезованого полісахариду досягає максимального значення (9,2г/л) уже на 96год росту продуцента на суміші етанолу і меляси, у той час як на суміші етанолу і глюкози така концентрація ЕПС спостерігається лише на 120год культивування бактерій. Таблиця 3 Залежність синтезу полісахариду на суміші субстратів від тривалості культивування Джерело вуглецю в середовищі культивування Тривалість процесу, год ЕПС, г/л 96 9,2 Етанол, 0,75% + меляса, 0,75% Етанол, 0,75% + глюкоза, 0,75% (прототип) 7,8 9,2 120 Таким чином, використання запропонованого способу дає змогу без зниження показників синтезу полісахариду скоротити тривалість культиву Комп’ютерна верстка І.Скворцова 9,2 120 96 вання продуцента на 24 год порівняно з прототипом. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601