Штам бактерій acinetobacter calcoaceticus k-4 – продуцент поверхнево-активних речовин

Штам бактерій Acinetobacter calcoaceticus K-4 - продуцент поверхнево-активних речовин. (19) (21) u200813911 (22) 03.12.2008 (24) 27.04.2009 (46) 27.04.2009, Бюл.№ 8, 2009 р. (72) ПИРОГ ТЕТЯНА ПАВЛІВНА, UA, АНТОНЮК СВІТЛАНА ІГОРІВНА, UA, СОРОКІНА АНАСТАСІЯ ІГОРІВНА, UA 3 ше штаму бактерій Acineiobacter calcoaceticus K-4, який відрізняється від вище згаданих тим, що здатний рости і синтезувати позаклітинні метаболіти з поверхнево-активними і емульгувальними властивостями на простому мінеральному середовищі з низьким вмістом солей (2,4 г/л) з використанням етанолу як субстрату. Штам A. calcoaceticus K-4 виділено із забруднених нафтою зразків ґрунту. Штам депоновано в Депозитарії мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ПАН України їм. Д.К.Заболотного під номером 1MB В-7241. Штам A calcoaceticus K-4 характеризується такими морфологокультуральними і фізіологобіохімічними ознаками. Клітини A. calcoaceticus К-4 в експоненційній фазі росту являють собою короткі палички, у стаціонарній - сферичні (кокоподібні), розміщені попарно, рідше - в коротких ланцюжках. Розміри клітин: 0,9-1,5х1,2-2,0 мкм. Спор не утворюють. Розмноження клітин здійснюється бінарним поділом. Клітини грамнегативні, нерухомі. У процесі росту на м'ясо-пептонному агарі (МПА) утворює слизові, прозорі колонії білого кольору з рівними краями, поверхня колоній - гладенька, розмір колоній 2-3 мм. Під час культивування A. calcoaceticus K-4 на рідких мінеральних середовищах з гідрофільними субстратами (етанол, глюкоза) утворюється однорідна гомогенна суспензія клітин молочного кольору, іноді - з жовтуватим відтінком. Під час вирощування на гідрофобних субстратах (рідкі парафіни) часто утворюються конгломерати клітин, а також спостерігається часткова їх флотація. Культивування A. calcoaceticus K-4 на середовищі з нафтою супроводжується коалесценцією нафти: за концентрації нафти 0,06 % (об'ємна частка) утворюються кульки діаметром 3-4 мм, а за 0,12 % нафти - диски діаметром до 7-8 мм і завтовшки 1-2 мм. Як джерело вуглецю і енергії використовує глюкозу, етанол, рідкі парафіни, гексадекан, а також здатний асимілювати нафту, гліцерин. Як джерело азотного живлення використовує органічний (сечовина) та мінеральний (нітратний, гірше амонійний) азот. Не потребує факторів росту, проте рівень біомаси і синтезованих поверхнево-активних речовин підвищується за присутності у середовищі дріжджового автолізату. Строгий аероб. Каталазопозитивний, оксидазонегативний, кислотонестійкий. Желатину не розріджує, крохмаль не гідролізує, нітрати не відновлює. Сірководень, індол та ацетоїн не утворює. Температурний діапазон росту 10-42°С. Оптимальна температура росту 24-30°С. рН 5,5-8,0. Оптимум рН 6,5-7,5. Умови зберігання. Штам зберігається при температурі +4°С на глюкозо-картопляному або м'ясопептонному агарі. Пересіви проводять через 3 місяці. Склад середовища для отримання посівного матеріалу і біосинтезу ПАР (%, масова частка). (NH2)2CO 0,55 NaCl 1,0 40848 4 Na2HPO4 0,6 КН2РО4 0,6 MgSO4x7H2O 0,1 FeSO4x7H2O 0,001 Вода дистильована до 1 л. Як інокулят використовували культуру з експоненційної фази росту, вирощену на мінеральному середовищі вказаного складу з 0,5 % (об'ємна частка) етанолу. Культивування A. calcoaceticus K-4 для отримання поверхнево-активних речовин здійснювали на качалці (220 об/хв.), коефіцієнт масопереносу 0,14 г О2 / л год, температура 30°С, рН середовища 6,8-7,0, тривалість культивування 120 год. Джерело вуглецю (етанол) - 2,0 % (об'ємна частка). Кількість посівного матеріалу - 5 % (об'ємна частка) від об'єму середовища. Показники, за якими визначали синтез ПАР. - Умовна концентрація ПАР (ПАР*), яку визначали для експрес-оцінки кількісного вмісту ПАР у культуральній рідині. Цей показник визначається як ступінь розведення вільної від клітин культуральної рідини у точці збільшення поверхневого натягу на кривій залежності σs від значення розведень. Абсциса точки перетину кривої відповідає значенню умовної концентрації ПАР та виражається в безрозмірних одиницях. - Емульгувальні властивості (індекс емульгування, Е24), які визначали через 24 год як величину відношення висоти шару емульсії до загальної висоти рідини у пробірці і виражали у процентах. Як субстрати для емульгування використовували соняшникову або вазелінову олію Індекс емульгування визначали для культуральної рідини, розведеної дистильованою водою у 50 раз. - Якісний склад ліпідів визначали методом тонкошарової хроматографії (ТШХ) на пластинках "Silufol" ("Kavalier", Чехія). Аналіз проводили за використанням наступних систем розчинників: неполярна система: гексан - діетиловий ефір (2:1); полярна система: хлороформ - метанол - вода (85:15:1). Ідентифікацію ліпідів здійснювали шляхом зафарбовування пластинок спиртовим розчином фосфорномолібденової кислоти и парами йода (фосфоліпіди, загальні ліпіди), розчином нінгідрину (пептидоліпіди), анісовим альдегідом і антроновим реактивом (гліколіпіди). Приклад 1. Здатність A. calcoaceticus К-4 синтезувати поверхнево-активні речовини за умов росту на етанолі. A. calcoaceticus К-4 культивували на мінеральному поживному середовищі наведеного вище складу. Супернатант культуральної рідини характеризувався такими показниками - умовна концентрація ПАР* - 3,8-3,9; індекс емульгування (Е24) розведеної у 50 раз культуральної рідини становить 85-90 %. Препарати поверхнево-активних речовин, синтезованих A. calcoaceticus К-4, є комплексом гліко- та пептидоліпідів. Нейтральні (неполярні) ліпіди (жирні спирти та кислоти) присутні у мінорних кількостях. Гліколіпіди представлені трегалозоміколатами і трегалозоацелатами. Нами вперше показано можливість синтезу позаклітинних низькомолекулярних поверхнево 5 40848 активних речовин ліпідної природи представниками роду Acinetobacter, оскільки в науковій, науково-технічній та патентній літературі такі дані відсутні. Приклад 2, Залежність синтезу поверхневоактивних речовин A. calcoaceticus К-4 від тривалості культивування. 6 A. calcoaceticus К-4 культивували на мінеральному поживному середовищі наведеного вище складу. Як джерело вуглецю і енергії використовували етанол (2,0 % за об'ємом). Тривалість культивування становила 72, 120 і 168 год. рівень синтезу поверхнево-активних речовин наведено у табл. 1. Таблиця 1. Вплив тривалості культивування на синтез ПАР за умов росту A. calcoaceticus K-4 на етанолі В. Тривалість культивування, год 72 120 168 ПАР* 2,9 3,9 3,9 Отже, максимальні показники синтезу ПАР спостерігаються на 120 год росту A. calcoaceticus K-4. Приклад 3. Порівняння здатності штамів A. calcoaceticus K-4 і R. erythropolis EK-1 до синтезу ПАР за умов росту на етанолі. A. calcoaceticus K-4 культивували упродовж 120 год на мінеральному середовищі наведеного вище складу. R erythropolis EK-1 вирощували Е24, % 85 90 90 упродовж 168 год на середовищі такого складу (%, масова частка): NaNO3 - 1,3; NaCl - 1,0; Na2HPO4 0,6; КН2РО4 - 0,14; MgSO4x7H2O - 0,1; FeSO4x7H2O - 0,001. Як джерело вуглецю і енергії використовували етанол у концентрації 2,0 % (об'ємна частка). У табл. 2 наведено основні показники синтезу ПАР A. calcoaceticus K-4 та R. erythropolis EK-1 (прототип) під час росту на середовищі з 2 % етанолу. Таблиця 2. Синтез ПАР у процесі росту A. calcoaceticus K-4 та R. erythropolis EK-1 на етанолі. Продуцент Вміст солей у середовищі, г/л Е24, % ПАР* Тривалість культивування A. calcoaceticus K-4 (даний винахід) 2,4 90 3,9 120 R. erythropolis EK-1 (прототип) 3,1 85 3,5 168 Отже, порівняно з прототипом штам A. calcoaceticus K-4 має такі переваги: - синтезує поверхнево-активні речовини на простому мінеральному середовищі з низьким вмістом солей - 2,4 г/л; Комп’ютерна верстка І.Скворцова Хімічний склад ліпідів Гліколіпіди, пептидоліпіди Гліколіпіди, загальні ліпіди, фосфоліпіди, пептидоліпіди - тривалість культивування менша - 120 год; - вищі показники синтезу ПАР у процесі росту на етанолі. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601