Штам бактерій rhodococcus erythropolis ek-1 – продуцент поверхнево-активних речовин

Штам бактерій Rhodococcus erythropolis EK-1 1MB Ac-5017 - продуцент поверхнево-активних речовин. (19) (21) a200503486 (22) 13.04.2005 (24) 15.11.2006 (46) 15.11.2006, Бюл. №11, 2006р. (72) Пирог Тетяна Павлівна, Волошина Ірина Миколаївна, Ігнатенко Сергій Вікторович (73) НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ (56) UA A 48901, 15.08.2002 UA C2 34894, 15.08.2003 UA C1 26495, 11.10.1999 UA A 22690, 07.04.1998 3 Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення є штам Pseudomonas sp. PS-17 [Пат. 10467 UA, МПК С 21 N 1/02. Штам Pseudomonas sp. SP-17 - продуцент позаклітинних біоПАР і біополімеру / Шульга О.М., Карпенко О.В., Елісєєв С.А., Щеглова Р.А., Вільданова-Марцишин P.I. - №95041549; Заявл. 05.04.95; Опубл. 25.12.96, Бюл. №4], який є продуцентом позаклітинних поверхнево-активних речовин (ПАР) (рамноліпідів) і біополімеру. В основу винаходу поставлено задачу одержання поверхнево-активних речовин з використанням невідомого раніше штаму бактерій Rhodococcus erythropolis ЕК-1, який відрізняється від вище згаданих тим, що здатний рости на простому мінеральному середовищі з низькім вмістом солей (3г/л) з використанням як гідрофільних (глюкоза, етанол) так і гідрофобних (гексадекан, рідкі парафіни) джерел вуглецю, не потребує внесення цитрату натрію як попередника синтезу ПАР, не потребує додавання факторів росту та мікроелементів. Штам Rhodococcus erythropolis ЕК-1 виділено із забруднених нафтою зразків ґрунту. Штам депоновано в Українській колекції мікроорганізмів (Інститут мікробіології і вірусології НАН України ім. Д.К.Заболотного) під номером 1MB Ас-5017. Штам Rhodococcus erythropolis ЕК-1 характеризується наступними культуральноморфологічними і фізіолого-біохімічними ознаками. Культурально-морфологічні ознаки. На 24год росту на м'ясо-пептонному агарі (МЛА) клітини мають вигляд нерухомих довгих паличок (3-8мкм), рідко зустрічаються палички довжиною 2-3мкм. Палички рівні та зігнуті. Іноді зустрічаються ланцюжки, що складаються з 3-6 коків. Переважно зустрічаються ланцюжки, що містять палички (2-5шт). На 24год росту на сусло-агарі (СА) клітини мають вигляд нерухомих, коротких паличок (23мкм), більшість з яких з'єднані попарно, та коків, які утворюють рівні та зігнуті ланцюжки. На 24год росту на глюкозо-картопляному агаризованому агарі (ГКА) клітини мають вигляд нерухомих, коротких паличок, довжиною 2-3мкм, рідко зустрічаються довгі (5-7мкм). Палички рівні та зігнуті. Кокові форми не виявлені. При рості на агаризованих середовищах штам Rhodococcus erythropolis EK-1 на 24год утворює складчасті (шорохуваті) колонії блідо-кремового (МПА) або блідо-оранжевого забарвлення (СА та ГКА). При вирощуванні штаму Rhodococcus erythropolis EK-1 на рідкому мінеральному поживному середовищі з гідрофільними субстратами (етанол, глюкоза) утворюється однорідна гомогенна суспензія клітин. На гідрофобних субстратах (гексадекан) залежно від умов культивування (масообмін, тривалість культивування, склад поживного середовища) може спостерігатись агрегація клітин у формі кульок різної форми та кольору (від кремового та рожевого до оранжевого), які знаходяться на поверхні середовища. Залежно від умов культивування відбувається зміна забарвлення 77345 4 культуральної рідини від молочно-білого до темнокоричневого кольору. Фізіолого-біохімічні ознаки. Як джерело вуглецю та енергії штам використовує глюкозу, сахарозу, фруктозу, маніт, оцтовокислий натрій, етанол, гексадекан, рідкі парафіни, керосин, а також здатний засвоювати нафту, цитрат натрію, бензин. Як джерело азоту штам використовує амонійний та нітратний азот. Не потребує факторів росту. Строгий аероб. Росте в діапазоні температур 10-34°С. Оптимум для росту - 30°С. Росте в діапазоні рН 6,0-8,5. Крохмаль не гідролізує, желатину не розріджує, сірководень не утворює, росте на середовищі з 3-5% хлористого натрію. Умови зберігання. Штам зберігається при температурі +4°С на глюкозо-картопляному або м'ясопептонному агарі. Пересіви проводять через 3 місяці. Склад середовища для отримання посівного матеріалу і біосинтезу ПАР, (мас.%). NaNO3 -1,3 NaCl-1,0 Na2HPO4-0,6 KH2PO4 - 0,14 MgSO4x7H2O-0,1 FeSO4x7H2O-0,001 Вода дистильована - до 1л. Як інокулят використовували культуру з експоненційної фази росту, вирощену на мінеральному середовищі вказаного складу з 0,5% етанолу або 0,3% гексадекану. Культивування Rhodococcus erythropolis EK-1 для отримання поверхнево-активних речовин здійснювали на качалці (220об/хв.), коефіцієнт масопереносу 0,14г O2/л год, температура 25°С, рН середовища 6,8-7,0, тривалість культивування 168 год. Джерело вуглецю (етанол або гексадекан) 2,0% (за об'ємом). Кількість посівного матеріалу 5% (за об'ємом) посівного середовища. Показники, за якими визначали синтез ПАР. Поверхневий натяг ( s , мН/м) супернатанту культуральної рідини, який вимірювали за допомогою платинової або скляної пластинки за методом Вільгельмі. Вміст загальних ліпідів (г/л) у культуральній рідині, який визначали ваговим методом після екстракції сумішшю Фолча (хлороформ - метанол 2:1). Умовна концентрація ПАР (ПАР*), яку визначали для експрес-оцінки кількісного вмісту ПАР у культуральній рідині. Цей показник визначається як ступінь розведення вільної від клітин культуральної рідини у точці збільшення поверхневого натягу на кривій залежності о, від значення розведень. Абсциса точки перетину кривої відповідає значенню умовної концентрації ПАР та виражається в безрозмірних одиницях. Емульгувальна активність (Е24), яку визначали через 24год як величину відношення висоти шару емульсії до загальної висоти рідини у пробірці і виражали у процентах. Як субстрати для емульгування використовували соняшникову або вазелінову олію Емульгувальну активність визначали 5 77345 для нативної культуральної рідини і культуральної рідини, розведеної дистильованою водою у 10 і 50 раз. Якісний склад ліпідів визначали методом тонкошарової хроматографії (ТШХ) на пластинках "Silufol" ("Kavalier", Чехія). Аналіз проводили за використанням наступних систем розчинників: неполярна система: гексан - діетиловий ефір (2:1); полярна система: хлороформ - метанол - вода (85:15:1). Ідентифікацію ліпідів здійснювали шляхом зафарбовування пластинок спиртовим розчином фосфорномолібденової кислоти и парами йода (фосфоліпіди, загальні ліпіди), розчином нінгідрину (пептидоліпіди), анісовим альдегідом і антроновим реактивом (гліколіпіди). Приклад 1 Штам Rhodococcus erythropolis EK-1 культивували на мінеральному поживному середовищі вищевказаного складу. Як джерело вуглецю та енергії використовували етанол (2,0% за об'ємом). Супернатант культуральної рідини характеризувався наступними показниками: Величина поверхневого натягу (Gs) 43,245,5мН/м, умовна концентрація ПАР* - 3,0-3,5, кількість синтезованих ПАР - 1,0-1,2г/л; індекс емульгування (Е24) розведеної у 50 раз культуральної рідини становить 80-85%. У складі ліпідів, синтезованих Rhodococcus erythropolis EK-1 на етанолі, виявлено гліколіпіди (трегалозомоно- і трегалозодикоріноміколати), та загальні ліпіди (цетиловий спирт, пальмітинова кислота, метило 6 вий ефір н-пентадеканової кислоти, тригліцерид, міколові кислоти). Нами вперше встановлена можливість синтезувати поверхнево-активні речовини представниками роду Rhodococcus на етанолі, тому як в науковій, науково-технічній та патентній літературі такі дані відсутні. Приклад 2 Штам Rhodococcus erythropolis EK-1 культивували на мінеральному поживному середовищі вищевказаного складу. Як джерело вуглецю і енергії використовували гексадекан (2,0% за об'ємом). Показники синтезу поверхнево-активних речовин: Величина поверхневого натягу ( s ) 29,429,8мН/м, умовна концентрація ПАР* - 6,0-6,5, кількість синтезованих ПАР - 8,0-8,5г/л; індекс емульгування (E24) розведеної у 50 раз культуральної рідини складає 46-50%. У складі ліпідів, синтезованих Rhodococcus erythropolis EK-1 на гексадекані, виявлені гліколіпіди (трегалозомоно- і трегалозодикоріноміколати), фосфоліпіди (фосфатидил-гліцерин, фасфатидилетаноламін, дифосфатидилгліцерин), пептидоліпіди та загальні ліпіди (цетиловий спирт, пальмітинова кислота, метиловий ефір н-пентадеканової кислоти, тригліцерид, міколові кислоти). У таблиці наведено основні показник! синтезу ПАР штамами Rhodococcus erythropolis EK-1 та Pseudomonas sp. PS-17 (прототип). № ПАР Загальний вміст солей у середовищі, г/л s ПАР, г/л Вихід від субстрату, % Хімічний склад ліпідів 1 Даний винахід 3 29,4 8,5 71 Гліколіпіди, загальніліпіди, фосфоліпіди, пептидоліпіди, 2 Прототип* 12 29,5 9,5 48 Рамноліпіди * - як джерело вуглецю використовували гліцерин. У порівнянні з прототипом штам бактерій Rhodococcus erythropolis EK-1 має такі переваги: здатність синтезувати поверхнево-активні речовини на простому мінеральному середовищі з низьким вмістом солей - 3г/л (для інших штамів продуцентів ПАР - до 12г/л); не потребують додат Комп’ютерна верстка В. Сердюк кового внесення у середовище мікроелементів та дріжджового автолізату; не потребує внесення у середовище попередників синтезу (цитрат натрію);характеризуються вищим виходом ПАР від субстрату. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601