Спосіб діагностики in vitro антигенної сумісності організму людини за ознакою ізоімунізації антигенами еритроцитів

Спосіб діагностики in vitro антигенної сумісності організму людини за ознакою ізоімунізації антигенами еритроцитів шляхом з'єднання досліджуваної сироватки крові з донорськими еритроцитами і комплементом, який відрізняється тим, що діагностику проводять в реакції аглютинації в мікропробірках, заповнених гелем з додаванням поліспецифічної антиглобулінової сироватки. (19) (21) u200900714 (22) 30.01.2009 (24) 25.05.2009 (46) 25.05.2009, Бюл.№ 10, 2009 р. (72) ДИЗИК ГАЛИНА МИХАЙЛІВНА, UA, ПАВЛЮК РАЇСА ПАНТЕЛЕЙМОНІВНА, UA, МИРОНЕНКО ГАЛИНА АНАТОЛІЇВНА, UA (73) ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "ІНСТИТУТ ГЕМАТОЛОГІЇ ТА ТРАНСФУЗІОЛОГІЇ АМН УКРАЇНИ", UA 3 Недоліками даного діагностичного тесту слід вважати: 1. Комплементзалежність реакції, через що необхідно в лабораторії мати комплемент. 2. В реакцію гемолізу вступають ізоантитіла, що відносяться як до ізотипу IgM (природні) так і до IgG (імунні). Внаслідок цього реакція визначає пул антитіл, що знижує інформацію про наявність саме імунних антитіл. 3. Реакцію гемолізу з метою діагностики антигенної сумісності організму людини за ознакою ізоімунізації антигенами еритроцитів необхідно проводити невідкладно, запобігаючи руйнуванню власного комплементу сироватки крові. У противному разі до сироватки необхідно додавати комплемент (див. п. 1). 4. Для визначення концентрації гемолізинів необхідно у досліджуваної особи отримати не менш як 2 мл сироватки крові. 5. Визначення гемолізинів потребує 4-5 годин робочого часу на виконання послідовно всіх етапів дослідження. Таким чином, названі фактори утруднюють точне визначення антигенної сумісності організму людини за ознакою ізоімунізації антигенами еритроцитів. Завданням способу, що пропонується, є підвищення точності візуальної оцінки in vitro антигенної сумісності організму людини за ознакою ізоімунізації антигенами еритроцитів, скорочення часу дослідження, зменшення необхідного для дослідження об'єму сироватки. Реакція аглютинації проводиться на площині, в пробірках або в мікропробірках, заповнених гелем з антиглобуліновим реагентом. Перша фаза реакції, яка полягає в поєднанні ізоімунних антитіл сироватки крові з відповідним антигеном на еритроцитах, наступна фаза - аглютинація еритроцитів під дією антиглобулінового реагента, заключна фаза -просіювання аглютинованих еритроцитів через гель - візуалізація результата. Спосіб, що пропонується, реалізується наступним чином: Реакція проводиться на картках, які являють собою пластикову пластинку, в яку запаяні 6 мікропробірок, заповнених гелем і з додаванням поліспецифічної антиглобулінової сироватки, і використовується для виявлення неповних імунних аглютинінів у непрямому антиглобуліновому тесті. Досліджувану сироватку в кількості 0,5 - 1мл розводять у чотири рази 0,9 % розчином натрію хлориду, щоб уникнути коагуляції під час нагрівання, потім розливають порівну в дві пробірки, одну з них прогрівають протягом 10хв. при температурі +70°С, точно дотримуючись температури і часу . Далі готують розведення прогрітої сироватки 0,9% розчином натрію хлориду від від 1:4 до 1:128. Для дослідження беруть дві картки, маркують їх, позначивши під кожною мікропробіркою розведення сироватки. Вносять в мікропробірки одної картки по 50мкл зависі еритроцитів ID-DiaCell А1, а в мікропробірки другої картки - ID-DiaCell В. В кожну з них додають по 25мкл досліджуваної прогрітої розведеної сироватки, відповідно маркуванню. 41604 4 Інкубують картки на протязі 15 хвилин при температурі 37°С, потім центрифугують в IDцентрифузі 10хв. і оцінюють результат дослідження. Позитивний результат свідчить про наявність анти-А і/або анти-В аглютинінів, а останнє розведення сироватки, в якому спостерігається аглютинація - про їх титр. Якщо аглютинація спостерігається у всіх пробірках, дослідження треба повторити з більшим розведенням сироватки. Негативний результат у всіх пробірках свідчить про відсутність неповних імунних антитіл. Приклад використання способу. Вагітна П-о, 25 років, група крові Оα,β (І), RhCD)+ вагітність перша, термін вагітності 32 тижні. Біологічний батько дитини має групу крові Аβ(II), Rh(D)+. Вагітна проходила обстеження на наявність гемолізинів у лабораторії жіночої консультації в термін гестації 8, 16 та 20 тижнів, гемолізини не були виявлені. Звернулась для обстеження в лабораторію ДУ "ІГТ АМНУ" за направленням пологового будинку, оскільки там виникла підозра імунного конфлікту за даними УЗ дослідження. Відомо, що при групі крові Оα,β (І) у жінки та при групі крові Ар(ІІ) у чоловіка, дитина може успадкувати батьківський фенотип і імунізувати матір фетальними еритроцитами Ар(ІІ), чим викликати несумісність з наступним розвитком гемолітичної хвороби новонароджених. Зважаючи на те, що на попередніх етапах гестації гемолізини не були виявлені, а титр природних антитіл, визначений в нашій лабораторії, при зверненні в 32 тижні вагітності, дорівнював: анти-А - 1:512, анти-В - 1:64, в той час як у донорів спостерігаються титри 1:8 - 1:16 [3] і, знаючи недоліки і недостатню інформативність тесту на гемолізини, нами проведено реакцію на наявність імунних аглютинінів у гелевому тесті. Виявлено: імунні аглютиніни анти-А в титрі 1:128. Виконання методики потребувало 50хв. Отримані дані свідчили про наявність ізоімунізації та про загрозу можливого розвитку у дитини гемолітичної хвороби новонароджених. Дані передано до пологового будинку для вирішення питання подальшого ведення вагітності. Таким чином, перевагами запропонованого способу діагностики in vitro антигенної сумісності організму людини за ознакою ізоімунізації антигенами еритроцитів є: 1. Реакція не потребує додавання комплементу, що скорочує час і спрощує процедуру виконання. 2. Використання в реакції антиглобуліного реагенту (проти IgG) гарантує виявлення саме імунних ізоантитіл, які є патогенетичними факторами патології, пов'язаної з ізоімунізацІєю. 3. Реакцію можна виконувати як терміново, та і у відстроченому порядку. 4. Виконання всіх етапів дослідження потребує 1,5-2 години, тобто в 2 рази менше, ніж виконання реакції гемолізу. 5 41604 5. Виконання реакції можливе у об'ємах досліджуваної сироватки в 4 рази менших у порівнянні з об'ємами сироватки, які потребує реакція гемолізу. Список використаної літератури. 1. Клиническая трансфузиология/ под ред. В.Рудковского и С.Павловского, 1974.- Варшава.Польское медицин, изд-во. с.172-173. 2. Е.Б. Жибурт Трансфузиология: Учебник СПб: Питер, 2002. - 736с. (С.232). Комп’ютерна верстка А. Рябко 6 3. У. Бойд Основы иммунологии. М.: «Мир», 1969.- 647с. (с.274 - 363). 4. Г.М. Дизик, Р.П. Павлюк, Л.Н. Лавровська та інш. Титр ізогемаглютининів як орієнтовний показник імунореактивності організму донорів// Укр. журнал гематол. та трансфузіол., 2005. - №4 (додатковий), 5. Гематологія і трансфузіологія: фундаментальні та прикладні питання /Матеріали наук.-практ.конф., Київ, 2005. - С. Ill -112. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601