Спосіб визначення летких жирних кислот у біологічних субстратах сільськогосподарських тварин

1. Спосіб визначення летких жирних кислот у біологічних субстрата х сільськогосподарських тварин, що включає осадження метафосфорною кислотою білків вихідного субстрату, відгін жирних кислот, що звільнилися, водяною парою із наступним їхнім кількісним визначенням титруванням гідро 43204 зми, присутність яких заважає нормальному визначенню через сильне спінювання. Спосіб здійснюють таким чином. Для визначення летких жирних кислот у плазмі сперми та сперміях відповідно беруть 15¸20 мл або 20¸40 мл сперми. Її вносять у центрифужну пробірку і центрифугують для відділення сперміїв при 3000 g протягом 5 хв. З метою осадження білків плазми до отриманого центрифугату додають свіжевиготовлений (не більше як за 30-36 годин) водний розчин МФК з розрахунку близько 0,45 мл. розчину на кожні 5 мл. плазми, що відповідає об'ємному співвідношенню 1:10¸12,5. Суміш залишають на 15-20 хвилин для коагуляції білку і центрифугують при вище вказаних умовах. У більшості випадків у такий спосіб вдається одержати прозорий безбілковий центрифугат. При спостереженні помутніння роботу припиняють. Особливо часто погане осадження білків спостерігається при роботі зі спермою у літній період. В цьому випадку необхідно використовувати техніку поступового осадження в декілька етапів. Причому спочатку додавати таку кількість МФК, що передує максимальному осадженню, тобто близько 0,3 мл розчину на кожні 5 мл плазми (1:16¸20) Суміш старанно розмішують, лишають на 15 хв., для коагуляції білків, а потім центрифугують 5 хв. Центрифуга т повинен бути прозорим. Якщо спостерігається помутніння, у пробірку додають ще один-два рази близько 0,1 мл МФК на 5 мл плазми (1:45¸50), і повторюють центрифугування. Відгін жирних кислот здійснюють за допомогою пристрою, зображеного на фігурі. Він являє собою модифікований апарат Маркгама для перегонки речовин із водяною парою і складається з пароутворювача 1, двогорлої перегінної колби 3 та холодильника 7. Перегінна колба з пароутворювачем з'єднана каналом подачі пару 2, а з холодильником через насадку Клайзена 5, яка одночасно виконує роль бризковловлювача. Верхня частина насадки закрита шліф-пробками 6. Які використовують для введення в колбу досліджуваної речовини 4. У попередньо прогріту протягом півгодини перегінну колбу переносять тільки абсолютно прозорий центрифугат. Вона повинна мати об'єм не менше 250 мл, що гарантує запобігання викидів не очищеного продукту в холодильник. Осад, що залишився в центрифужній пробірці, промивають декількома мілілітрами бі-дистельованої води і після центрифугування при вище зазначених умовах надосадову рідину приєднують до вмісту колби. При аналізі сперміїв до них додають 1-2 мл. МФК на 1 г субстрату (1 об'ємна частина до 0,5¸1 вагових частин сперміїв), ресуспендують, витримують спочатку на протязі 15-20 хвилин, а потім, після додавання 10-кратної кількості дистильованої води іде 10-15 хвилин. Після цього суміш центрифугують при вище вказаних умовах. Як і в випадку плазми для подальшого аналізу використовують центрифугат, який переносять у перегінну колбу. Для поліпшення відгону кислот у перегінну колбу додають рівну кількість насиченого розчину сульфату магнію. Практично повний відгін жирних кислот спостерігається лише у випадку інтенсивного нагрівання пароутворювача на газовому пальнику з таким розрахунком, щоб 60 мл дистиляту зібрати за 10-15 хвилин. За цей час летючі жирні кислоти відгоняться з водяною парою. Спочатку збирають 60 мл основного дистиляту, а потім для контролю додатково відбирають ще 20-30 мл. Титрування, для визначення сумарної концентрації жирних кислот, доцільно проводити 0,02-0,05 молярним розчином гідроксиду натрію в присутності 0,04% розчину бромтимолового синього, або фенолфталеїну з мікробюретки місткістю 2 мл при постійній аерації дистиляту. За різницею показників титрування досліду і контролю і визначається сумарна концентрація досліджуваних кислот. Отриманий розчин солей жирних кислот випарюють до обсягу в декілька мілілітрів, переносять у пеніцилінові флакони і завершують випарювання. Проби аналізують на ГР-хроматграфі або герметизують для тривалого зберігання. Таким чином, нормалізація умов проведення відгону кислот забезпечує високу точність титрування, що в свою чергу дає можливість кількісного визначення жирнокислотного складу досліджуваного субстрату. Чистота одержуваного дистиляту забезпечує можливість подальшого проведення якісного аналізу кислот на ГР-хроматографі і високу достовірність одержуваних результатів. 2 43204 Фіг. __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2002 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 3