Застосування способу імуноферментного аналізу як способу кількісного визначення вмісту інтерферону в лікарських засобах

Застосування способу імуноферментного аналізу як способу кількісного визначення вмісту інтерферону в лікарських засобах. (19) (21) u200903696 (22) 15.04.2009 (24) 12.10.2009 (46) 12.10.2009, Бюл.№ 19, 2009 р. (72) БОРЩЕВСЬКИЙ ГЕНАДІЙ ІЛЛІЧ, КОНОВАЛЕНКО ВАДИМ АНАТОЛІЙОВИЧ, КОЛОСОВСЬКА ОЛЕНА СТЕПАНІВНА 3 44582 ного агрегату, визначення його кількості з використанням методів світлорозсіювання та статистичну обробку отриманих даних. Перевагою цього способу є: - висока стандартність компонентів реакції; - чуттєвість і специфічність тест-системи, що дозволяє кількісно визначити інтерферон-альфа в препараті; - інструментальний облік результатів; - невелика тривалість проведення аналізу (з пробо підготовкою приблизно 5 годин); - менша трудомісткість процесу визначення; - проведення кількісного визначення в процесі виробництва (приготували, профільтрували, визначили активність і розлили). 4 Спосіб здійснюють таким чином Імуноферментний метод Визначають методом ІФА за допомогою комерційної тест-системи Human IFN-d Multi-Subtype ELISA Kit, виробництва фірми «PBL Biomedical laboratories Interferon Source», CШA, кат. №41100 згідно з інструкцією до застосування або іншої комерційної тест-системи, з аналогічною чутливістю. Активність порівнюють відносно стандарту інтерферон альфа-2b NIBSC для визначення активності з активністю 70000 ОД/500пг. Готують буферний розчин, рН 7.0 згідно з таблицею 1, на 0.5л буферного розчину. Таблиця 1 № Назва компонентів Трис Трис НСl Лізина НСl Динатрію едетат Калію хлорид 1 2 3 4 5 Проводять стерильну фільтрацію буферного розчину через фільтр PALL, Fluorodayne II Membrane (PVDF) # 61300 з діаметром пор 0.22мкм. Розливають в стерильні флакони, укупорюють. Розчин зберігають при температурі (2-8)°С протягом 6 місяців. Стандартний розчин Розводять 2-й інтернаціональний стандарт інтерферону альфа 2b: ампулу стандарту розморожують, розчиняють стандарт в Розрахункова кількість, г 0.2 1.75 3.65 0.25 3.4 1мл. стерильної дистильованої води. Розведений стандарт розливають в стерильні скляні флакони, закупорюють та заморожують. Аліквоти стандарту зберігають при температурі - 40°С і нижче. Повторне розморожування не допускається. Відбирають і вносять 10мкл стандарту інтерферону в пробірку №1. Додають в пробірки буферний розчин для розведення зразків з набору до тест-системи згідно з таблицею 2. Таблиця 2 № Стандарт, мкл 1 2 3 4 10 500 з пробірки №1 500 з пробірки №2 500 з пробірки №3 Буфер для розведення, мкл 990 500 500 500 Прийнята активність, МО/мл 700 350 175 87,50 Кількість білку в 1мл 5000пг 2500пг 1250пг 625пг Субстанцію розводять в 400000 разів до концентрації 500МО/мл згідно з таблицею 3. Таблиця 3 № 1 2 Субстанція, мкл 25 5 Буфер для розведення, мкл 100000 995 Субстанцію інтерферону розморожують при кімнатній температурі та 2мг субстанції розчиняють в 1мл стерильного буферного розчину рН7.0. В першу лунку планшету вносять 100мкл буферного розчину (табл. 1). В інші лунки 96-ти лункового планшету вносять проби стандарту в 2-х повторностях, починаючи з найменшої концентрації: 87.5МО/мл, 175МО/мл, 350МО/мл, 700МО/мл. В наступні лунки планшету вносять проби розчину, який випробовують в 2-х повторностях. Проводять випробовування згідно з інструкцією до використання тест-системи. За допомогою Розрахункова активність, МО/мл 100000 500 програмного забезпечення будують калібрувальну криву за 4 параметрами: по вісі Y - адсорбція стандартних зразків, по вісі X - концентрація стандартних зразків. За допомогою калібрувальної кривої визначають активність інтерферону альфа - 2b у розчині. В якості стандарту у способі, що заявляється використовували людський інтерферон-альфа, що входить до комплекту тест-системи та 2-й міжнародний стандарт 1999 с. 95/566 NIBSC. Отримані результати порівнювали з результатами біологічного контролю на культурі клітин. 5 44582 6 Таблиця 4 Порівняльна таблиця показників противірусної активності розчинів інтерферону (препарат назальний по 100000МО/мл по 5мл у флаконі скляному, субстанції інтерферону альфа-2b) Номер серії 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 01 02 Біологічний спосіб. СпеІмуноферментний спосіб. Очікувана активність Згідно з цифічна активність, МО/мл Специфічна активність, МО/мл регламентом, МО/мл Краплі: 100000МО/мл 157194МО/мл 160000МО/мл 100000МО/мл 170866МО/мл 160000МО/мл 100000МО/мл 154714МО/мл 160000МО/мл 100000МО/мл 129130МО/мл 160000МО/мл 150000МО/мл 166946МО/мл 160000МО/мл Спрей: 150000МО/мл 129160МО/мл 155000МО/мл 150000МО/мл 172140МО/мл 155000МО/мл 130000МО/мл 129466МО/мл 155000МО/мл 150000МО/мл 175108МО/мл 155000МО/мл 150000МО/мл 168860МО/мл 155000МО/мл 130000МО/мл 147580МО/мл 155000МО/мл 150000МО/мл 153480МО/мл 155000МО/мл 150000МО/мл 165048МО/мл 155000МО/мл Субстанція 4x108МО/мл 3,8х108МО/мл 8 4x10 МО/мл або 3,7x108МО/мл, або 2,0х108МО/мг 1,85х108МО/мг Отримані дані підтверджують відповідність результатів (архівних серій) при визначення вмісту інтерферону (МО/мл) імуноферментним способом Комп’ютерна верстка А. Рябко і визначення на культурі клітин з використанням вірусу-індикатора (біологічний спосіб). Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601