Спосіб суперсинтезу рекомбінантного білка rexhcd34 продуцентом штаму е.coli bl21hcd34

Спосіб суперсинтезу рекомбінантного білка rExhCD34 продуцентом штаму Е.coli BL21hCD34, який включає культивування продуценту на середовищі, що містить лактозу і глюкозу. (19) (21) u200905800 (22) 05.06.2009 (24) 12.10.2009 (46) 12.10.2009, Бюл.№ 19, 2009 р. (72) КОРДЮМ ВІТАЛІЙ АРНОЛЬДОВИЧ, ГІЛЬЧУК ПАВЛО ВОЛОДИМИРОВИЧ, ІРОДОВ ДМИТРО МИХАЙЛОВИЧ, ФЛЯК АНДРІЙ ІГОРОВИЧ, ГОР 3 ції тварин, який, у свою чергу, є значно дешевшим, однак потребує наявності великої кількості високо очищеного білка CD34, що є неможливим у разі використання екстрактів CD34+ клітин як єдиного джерела даного антигену. Відомий CD34-антиген людини Г.І. походження, продукований трансфікованою лінією клітин ссавців COS під контролем промотору плазміди CDM8. Плазміда для синтезу рекомбінантного CD34 містить в собі кДНК послідовність гена CD34 із лінії клітин KG1 розміром 2615.П.Н. Білок CD34 синтезується культурою клітин еукаріотів на поверхні плазматичної мембрани у вигляді продукту 110кДа (Simmons, D.L., Satterthwaite, A.B., Tenen, D.G. and Seed В., Molecular cloning of a cDNA encoding CD34, a sialomucin of human hematopoietic stem cells. J Immunol, 1992. 148(1): p.267-71.). Зазначений спосіб одержання антигену CD34 має суттєві недоліки, серед яких можна вказати низький рівень його синтезу клітинами еукаріотів, довготривалість культивування та нестабільність трансфікованої клітинної лінії, високу вартість поживних середовищ, неможливість одержання препаративної кількості антигену в умовах лабораторії і складність процедури його очищення. Також гетерогенний характер приєднання глікозильних залишків до поліпептидного ланцюгу CD34 у разі його синтезу трансфікованою лінією еукаріотичних клітин змінює антигенні властивості CD34, що, в свою чергу, ускладнює його використання у процедурах одержання універсальних специфічних полі- і моноклональних антитіл проти білкових детермінант. У той же час генно-інженерні технології дозволяють клонувати гени еукаріотів і забезпечувати їх високоефективну експресію в бактеріях Е. соlі (Т. Маніатіс "Молекулярне кло-нування-Лабораторна збірка методик'9, Колд Спрінг Харбор Лабораторі, Колд Спрінг Харбор, том 1-3. 1989p.). Потім білок може бути виділений з бактеріальних клітин і очищений за відомими методиками. У таких спосіб рекомбінантний антиген CD34 може бути одержано у кількостях, необхідних для імунізації тварин, продукування специфічних поліклональних антитіл та їхнього очищення. У той же час технологія одержання рекомбінантного антигену CD34 людини потребує розробки ефективного та дешевого способу суперпродукції рекомбінантного антигену в бактеріях. В основу пропонованої корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб суперсинтезу рекомбінантного білка RExHCD34 продуцентом штаму Е. Соlі, який би забезпечив оптимальний спосіб продукування рекомбінантного білка rExhCD34 та був би більш дешевшим і технологічним. Поставлена задача вирішується пропонованим способом суперсинтезу рекомбінантного білка rExhCD34 продуцентом штаму Е. coli BL21hCD34, який включає культивування продуценту на середовищі, що містить лактозу і глюкозу. Продукування рекомбінантного білка rExhCD34 в бактеріальних клітинах може бути здійснено з використанням методик, відомих спеціалістам даної галузі. Однак, як вказано, дана корисна модель забезпечує оптимальний спосіб продукування рекомбінантного білка rExhCD34, за 44814 4 допомогою якого досягається максимальне накопичення цільового білка штамом продуцентом у лабораторних умовах, а також використовується лактоза, яка є значно дешевшою ніж загальновживаний індуктор експресії ізопропіл-бета-Dгалактопіранозид (ІПТГ). Відповідно до пропозиції спосіб суперсинтезу модифікованого генноінженерного рекомбінантного білка rExhCD34 штамом продуценту Е. coli BL21hCD34 полягає у інокуляції аліквоти бактеріальної культури із вихідного її стоку безпосередньо у поживне рідке середовище, що містить лактозу і глюкозу у кінцевих концентраціях, 0.2% і 0.05% відповідно. Культивування проводили при 30 або 37°С і інтенсивній аерації протягом 20-24год., кінцева оптична щільність культури продуценту індукованої у такий спосіб складала ОD600=12-15. Вихід рекомбінантного білка rExhCD34, який становить до 500мг на 1л клітинної суспензії, визначали електрофоретичним розділенням сумарних білків продуценту в 12%-му поліакриламідному гелі з наступним денситометруванням електрофореграм і порівнянням цільового білка із білком відомої концентрації відповідно до стандартної методики денситометрії білків, відомої спеціалістам даної галузі. Синтезований білок rExhCD34 виявлявся в клітинних лізатах продуценту і у фракції нерозчинних білків після індукування експресії за вищенаведеним способом у вигляді домінуючої полоси розміром близько 30кДа (Фіг.1). Суть корисної моделі пояснюється Фіг.1 - електрофоретичний аналіз експресії білка rExhCD34 штамом продуцентом BL21HCD34, де 1 - сумарний лізат клітин продуценту після культивування протягом 20 год. у присутності індуктора експресії; 2 фракція нерозчинних білків клітин (тільця включення); 3 - фракція розчинних білків клітин; 4 - маркер молекулярної маси білків. Приклад Суперсинтез рекомбінантного білка rExhCD34 в бактеріях Е. cоlі. Для одержання rExhCD34 використовували штам Е. coli BL21(DE3), трансформований плазмідою pRExCD34, яка має маркер селекції канаміцин-резистентності. Плазміда забезпечує індукований аналогами лактози синтез цільового білка, який нагромаджується в цитоплазмі клітин бактерій в ранній стаціонарній фазі росту культури у вигляді тілець включення. Культивування бактерій проводили у 4л колбах при 37°С на середовищі 2xYT (17г/л бактотриптону; 10г/л дріжджового екстракту; 5г/л NaCl) з 50мкг/мл канаміцину, 25мМ (NH4)2SO4, 50мМ КН2РO4, 50мМ Na2HPO4, 1мМ MgSO4, 0.05% глюкозю, 0.2% а-лактозою, 0.5% гліцеролом, протягом 16-24 годин на шейкеріінкубаторі за інтенсивної аерації (150-200 об/хв.). Після закінчення культивування клітини осаджували центрифугуванням при 3000g 10 хвилин при 4°С, надосадову рідину видаляли, а осад суспендували в 10мМ буфері Трис-НСl, рН 8 (10мл буферу на 1г клітинного осаду), який містив 1мг/мл лізоциму і 50мкг/мл ДНК-ази і інкубували 20 хвилин за кімнатної температури. Суспензію клітин обробляли ультразвуком на ультразвуковому дезинтеграторі і центрифугували 15 хвилин при 5 44814 10000g. Супернатант видаляли, а осад суспендували в 10мМ буфері Трис-НСІ, рН8, який містив в собі 0,5% дезоксихолату натрію. Промивання здійснювали шляхом повного суспендування нерозчинного білка на ультразвуковому дезінтеграторі з наступним відділенням осаду центрифугуванням. Одержані тільця включення, які містили рекомбінантний білок rExhCD34, зберігали при - 70°С. Одержання різних фракцій білків Е. соїі, приготування проб для електрофоретичного розділення в поліакриламідному гелі проводили за стандартними методами (Sambrook, Joseph Molecular cloning: a laboratory manual/ E.F. Fitsch, T. Maniatis -2-nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989 V.3 p. 18.49-18.57). Для приготування проб білків використовували розведений у 6 разів концентрат буфер складу: 0,3 М трис-НСl; 25% гліцерин; 3,5% додецилсульфат натрію; 0,6М 2меркаптоєтанол, 0,5% бромфеноловий синій рН Комп’ютерна верстка А. Рябко 6 (6,8). Електрофорез білків проводили за методом U. Laemmli (Westermeier R. Electrophoresis т practice: a guide to methods and applications of DNA and protein separations. - Weinheim: VCH, 1997. - P. 331), використовуючи для їхнього розділення 1215%-й поліакриламідний гель з 0,1% додецилсульфату натрію. Кількість сумарного білка у різних фракціях клітин визначали методом М. Bradford (Дарбре А. Практическая химия белка: Пер. с англ. - М.: Мир, 1989. - 623с, с.297 - 298). Рівень експресії rExhCD34 штамом продуцентом визначали за допомогою сканування і денситометрії електрофореграм використовуючи як стандарт БСА з відомою концентрацією для одержання калібрувальної кривої. Представлена на Фіг.1. електрофореграма показує суперсинтез рекомбінантного білка rExhCD34 бактеріальним штамом-продуцентом і його накопичення у нерозчинній фракції білків клітин - тільцях включення. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601