Тест-система імуноферментна для визначення антитіл проти грам-негативних бактерій

Тест-система імуноферментна для визначення антитіл проти грам-негативних бактерій на основі комплексів поверхневих антигенів грамнегативних бактерій та моноклональних мишачих антитіл проти імуноглобулінів людини, кон'югованих з пероксидазою, яка відрізняється тим, що містить адсорбовані мукополісахариди поверхневих антигенів бактерій в лунках планшета для імуноферментного аналізу в кількості 0,25-0,5 мкг. (19) (21) u200900661 (22) 29.01.2009 (24) 26.10.2009 (46) 26.10.2009, Бюл.№ 20, 2009 р. (72) ПАРХОМЕНКО ЛАРИСА ВАСИЛІВНА, ІВАНСЬКА НАІЛЯ ВАЛЕЕВНА, МОРОЗ ЄВГЕН ДЕНИСОВИЧ, ТИМОХІНА ЛЮДМИЛА ВОЛОДИМІРІВНА, ГАЛАГУЗА ЮРІЙ ПЕТРОВИЧ (73) ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "ІНСТИТУТ ЕПІДЕМІОЛОГІЇ ТА ІНФЕКЦІЙНИХ ХВОРОБ ІМ. Л.В. ГРОМАШЕВСЬКОГО АМН УКРАЇНИ" 3 44895 вмісту антигену 0,25-0,5мкг в 100мкл. По 100мкл вносять в кожну лунку планшети, окрім контролю №2, та залишають на ніч у холодильнику для адсорбції. Тест-систему розробляють у двох варіантах. У першому варіанті планшетку розраховують на дослідження одночасно 8 сироваток в двох чи трьох розведеннях з 4 комплексними антигенами при 4 контролях: К1 включає антигени+імуноглобулін+моноклональні антитіла та К2 включає комплексні антигени бактерій досліджуваних родів (табл. 1). У другому варіанті отримують дані при дослідженні одночасно 46 сироваток на 1 планшетці в одному розведенні із комплексними антигенами Escherichia або Pseudomonas та при двох контролях. Таблиця 1 1-й варіант ІФА тест-системи 1 Е Е Е Е Е Е Е Е 2 Е Е Е Е Е Е Е Е 3 Е Е Е Е Е Е Е Е 4 Р Р Р Р Р Р Р Р 5 Р Р Р Р Р Р Р Р 6 Р Р Р Р Р Р Р Р 7 В В В в в в в в Літерами позначені комплексні антигени, внесені в лунки планшетки: Е - комплексний антиген бактерій Escherichia, Р комплексний антиген бактерій Pseudomonas В - комплексний антиген бактерій Proteus S - комплексний антиген бактерій Salmonella Потім планшетку відмивають і вносять в лунки 1-10 по 100мкл сироватки в розведеннях 1:2401:960 або 1:240-1:480, в 11 - розчин специфічного імуноглобуліну. Інкубують в термостаті при 37°С 2 часа. Потім планшетку відмивають і вносять по 100мкл розчину моноклональних антитіл в лунки 1-11. Внаслідок додавання моноклональних антитіл утворюється комплекс антиген-антитіло. Після відмивання планшету в лунки вносять розчин проявителю, який містить субстрат пероксидази пере 8 в в в в в в в в 9 S S S S S S S S 10 S S S S S S S S 11 К-1 К-1 К-1 К-1 К-1 К-1 К-1 К-1 12 К-2 К-2 К-2 К-2 К-2 К-2 К-2 К-2 кис водню та хромоген тетраметилбензидин. Пероксидазну реакцію зупиняють за допомогою стопреагенту. При позитивної реакції в лунках з досліджуваним препаратом колір стає жовтим. Негайно вимірюють оптичну густину суміші в лунках при 492нм. Якісно позитивну реакцію обліковують шляхом порівняння кольору в лунках із досліджуваними препаратами та контрольною позитивною сироваткою. Приклад 2. Визначення чутливості тестсистеми. Для визначення чутливості тест-системи застосують специфічний імуноглобулін, отриманий за Коном. Проведено 8 досліджень при 3-х повтореннях зі застосуванням різних антигенів. Результати досліджень наведені у табл. 2. Таблиця 2 Чутливість тест-системи Антигени Escherichia Pseudomonas Proteus Salmonella суміш E. coli-ЛПС Re-гліколіпід О-антиген (ТХУ)Е. coli 1:20 + 4+ + + + 1:60 + + + + + + Розведення специфічного імуноглобуліну 1:120 1:240 1:480 1:960 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + З таблиці видно, що в специфічному імуноглобуліні тест-системою антитіла проти комплексних поверхневих антигенів грам-негативних бактерій Escherichia, Pseudomonas, Proteus, Salmonella виявляються у високих титрах, в той час як з іншими антигенами (Е.соlі-ЛПС, Re-гліколіпід, О-антиген 1:1920 + + + (ТХУ) Е.соlі) реакції або немає, або виявляються дуже низькі титри. Чутливість отриманих тест-систем приблизно відповідає титрам антитіл специфічного імуноглобуліну в РПГА з еритроцитарними діагностикумами, щодо необхідної кількості антигенів в одній 5 44895 лунці планшету, то відмінність була у 1,5-3 рази, тобто 0,25-0,5мкг. Приклад 3. Специфічність розробленої тестсистеми. Для виявлення специфічності тест-системи (табл. 3) досліджують донорські специфічні сироватки, які вміщують в великих титрах антитіла про 6 ти окремих родів грам-негативних бактерійзбудників сепсису. В якості контролю специфічності тест-системи застосовують: антистафілококовий імуноглобулін, сироватки крові людини, які не вміщують антитіла проти поверхневих антигенів грамнегативних бактерій, та сироватку крові людини після одужання від стрептококової інфекції. Таблиця 3 Специфічність розробленої тест-системи Назва сироваток Анти-Escherichia Анти-Pseudomonas Анти-Proteus Анти-Staphylococcus Анти-Streptococcus Без вмісту анти-тіл проти грамбактерій 1:10 + + + + + 1:30 + + + + + + Проведено визначення специфічності запропонованої тест-системи в дослідженні 6 сироваток при 4-х повтореннях. Результаті дослідження наведені у табл. 3. Із таблиці видно, що специфічні сироватки (Анти-Escherichia, -Pseudomonas, Proteus,) дають позитивні реакції в тест-системі у великих розведеннях, в той час як неспецифічні (анти-Staphylococcus, анти-Streptococcus, без вмісту антитіл проти грам-негативних бактерій) - у низьких. Специфічність розробленої тест-системи для скринінгу донорської крові, плазму якої відбирають для заготівлі здебільшого при позитивному результаті дослідження сироватки з вмістом антитіл не менше ніж 1:240, складає 100%. Використана література Комп’ютерна верстка М. Ломалова Розведення сироваток 1:120 1:240 1:480 + + + + + + + + + 1:960 + + + 1:1920 + + 1. Дяченко В.Ф., Н.Ф. Дзюбан, В.Н. Щетинина. Возможности диагностики синегнойной инфекции с помощью эритроцитарного діагностикума - носителя общего синегнойного антигена. В кн.: Всесоюзная научно-практическая конференция «Проблемы клинической микробиологии в неинфекционной клинике», М., 1983, с.146. 2. W. Nimmich. Zur Isolirung und qualitativen Bausteinanalyse der К - Antigene von Klebsiellen // Z. Med. Mikrobiol. Immunol. - 1968. - vol. 154. - p.117131. 3. Scott, J.E. Aliphatic Ammonium salts in the Assay of Acidic Polysaccharides from Tissues. //Methods Biochem. Anal. - 1960. - vol. 8. - p.145197. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601