Спосіб мікрокількісного визначення ліпідів в тканинах гідробіонтів

Спосіб мікрокількісного визначення ліпідів у тканинах гідробіонтів, що включає калориметричний аналіз ліпідів у тканинах гідробіонтів, при якому ліпіди екстрагують із тканин різними розчинниками, потім розчинники випарюють, додають концентровану сірчану кислоту, спалюють ліпіди в 3 ної кривої використали концентрації 30, 60, 90, 120, 150 і 180мкг/мол. Розчинники були вилучені з ліпідних зразків під струмом азоту в алюмінієвій жаровій шафі при температурі 80-100°С. Після охолодження пробірок у кожну додавали по 2 мол концентрованої сірчаної кислоти. Через 15сек пробірки були поміщені в алюмінієву жарову шафу при 200°С на 15хв. Температура усередині пробірок у жаровій шафі повинна відслідковуватися в діапазоні 2°С у період спалювання. Потім пробірки були поміщені у воду кімнатної температури на 15сек., а потім перенесені в крижану лазню на 5хв. Після охолодження пробірки були витягнуті із крижаної лазні й залишені на 10хв. або до зникнення всіх пухирців. Оптична щільність вимірялася на спектрофотометрі при 375мкм. Відомий спосіб володіє рядом недоліків: - ліпіди, використовувані як стандарти, попередньо були очищені методом препаративної тонкошарової хроматографії на пластинах Silica Gel G, що вимагає додаткових витрат праці, часу й токсичних реактивів; - метод призначений для спалювання 5-300мкг ліпідів у пробі, без тонкої розбивки й пророблення найбільш важливого для дослідження мікродіапазону до 30мкг ліпідів у пробі; - розчинники видаляють із ліпідних зразків під струмом азоту в алюмінієвій жаровій шафі при температурі 80-100°С, що трудомістко; - температура усередині пробірок у жаровій шафі повинна відслідковуватися в діапазоні 2°С у період спалювання, що висуває високі вимоги до технічних характеристик шафи й вносить додаткові витрати праці. Ціль дійсної роботи - вдосконалити відомий метод кількісного визначення ліпідів у тканинах риб і інших гідробіонтів для характеристики ліпідного статусу, що відбиває енергетичний потенціал гідробіонтів і їхню пристосованість до умов середовища. Попередні результати свідчать про надійність, простоту, репрезентативність і перспективність застосування цього методу для гідробіологічних та інших досліджень. В основу корисної моделі "Спосіб мікрокількісного визначення ліпідів у тканинах риб і інших гідробіонтів" поставлене завдання шляхом зміни технологічних режимів забезпечити дослідників простим і надійним способом мікровизначення ліпідів у тканинах риб і інших гідробіонтів. Поставлене завдання досягається наступним шляхом. У способі мікровизначення ліпідів у тканинах гідробіонтів ліпіди екстрагують із тканин різними розчинниками, потім розчинники випарюють, спалюють висушені ліпіди в концентрованій сірчаній кислоті й проводять спектрофотометричне визначення оптичної щільності пофарбованих розчинів ліпідів. Спосіб, що заявляється, відрізняється тим, що ліпіди, використовувані як стандарти для побудови каліброваної кривої, попередньо не очищують. Стандартні розчини готовлять у хлороформі й для побудови каліброваної кривої використають концентрації 10, 20, 25, 30, 35, 40 і 60мкг/мол. Розчинники видаляють із ліпідних зразків без струму азоту в термостаті при температурі 80-100°С протягом 15-20 хвилин, а після охоло 45336 4 дження пробірок і додавання в кожну концентрованої сірчаної кислоти вміст обов'язково ретельно обмивають на дні й струшують. Після цього пробірки витримують у термостаті при 200°С у плині 15 хвилин, потім поміщають спочатку - на короткий час - у воду кімнатної температури, й потім - на 5хв. у крижану лазню, вимірюють оптичну щільність на спектрофотометрі при довжині хвилі 375мкм і розрахунок змісту ліпідів здійснюють по рівнянню у=87,403х+6,21, де X - оптична щільність, а у - кількість ліпідів у мкг. Приклад. Ліпіди екстрагують із різних тканин (печінки, м'язів) риб (йорша, султанки, зеленухи) сумішшю гексана й ізопропанола. Суміш гексана й ізопропанола видаляють із ліпідних екстрактів у термостаті при температурі 80-100°С протягом 15-20 хвилин. Після охолодження пробірок, у кожну додають по 2 мол концентровані сірчані кислоти й вміст дуже ретельно обмивають на дні й обережно струшують. Потім пробірки поміщають у термостат при 200°С на 15хв. Після цього пробірки поміщають у воду кімнатної температури на короткий час, а потім відразу переміщають у крижану лазню на 5хв. Потім вимірюють оптичну щільність на спектрофотометрі при довжині хвилі 375мкм. Для побудови як можна більш адекватної каліброваної кривої були опробирувані різні види ліпідів (холестерин, масло виноградних кісточок). У розчини холестерину обов'язково додають небагато антиоксиданту ВНТ для запобігання процесів перекісного окислювання ліпідів. Стандартні розчини холестерину й масла виноградних кісточок були приготовлені в хлороформі й для побудови каліброваної кривої використали концентрації 10, 20, 25, 30, 35, 40 і 60мкг/мол. Далі все кількісне визначення ліпідів проводили за описаною схемою. Рівняння для розрахунку змісту ліпідів у=87,403х+6,21. Запропонований спосіб володіє рядом переваг: - запропонований простий, ефективний і репрезентативний спосіб кількісного визначення ліпідів у тканинах риб і інших гідробіонтів; - даний спосіб застосуємо для точного визначення мікрокількостей ліпідів 10-60мкг у мол, що підтверджується характером і рівнянням каліброваної кривої; - розчинники видаляють із ліпідних зразків без струму азоту в термостаті при температурі близько 100°С 15-20 хвилин; - температуру усередині пробірок у жаровій шафі можна не відслідковувати в діапазоні 2°С у період спалювання. Даний спосіб може бути застосуємо для точного визначення мікрокількостей ліпідів до 60мкг також у тканинах теплокровних тварин і людини. Заявлений спосіб може бути використано як експрес-метод для оцінки фізіологічного статусу живих організмів, зокрема гідробіонтів, в умовах забруднення. 5 Комп’ютерна верстка Л. Купенко 45336 6 Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601