Спосіб визначення кількості ліпідів в біологічних об’єктах при проведенні гістологічних і гістохімічних досліджень

Винахід відноситься до ветеринарної медицини і може бути використаний при проведенні патоморфологічних досліджень. При проведенні звичайних гістологічних досліджень ліпіди в клітинах і тканинах взагалі не виявляються. Відомий спосіб проведення загальноприйнятих гістохімічних досліджень ліпідів, в якому вони виявляються в клітинах і тканинах фарбуванням спеціальними барвниками, які дозволяють виявити наявність і локалізацію цих речовин. Проте, про кількість ліпідів при цих методах досліджень можна говорити лише досить приблизно є немає, більше - менше (Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. - М.: Мир, 1969. 648с.; Кононский А.И. Гистохимия. - К.: Вища школа, 1976. - 280с.; Луппа X. Основы гистохимии. - М.: Мир, 1980. 343с.). Відомий спосіб не дозволяє провести кількісну оцінку вмісту ліпідів в біологічних об'єктах при проведенні гістологічних і гісто хімічних досліджень. Винаходом ставиться завдання розробити спосіб одночасного визначення кількості і локалізації ліпідів в біологічних об'єктах при проведенні гістологічних і гісто хімічних досліджень. Поставлене винаходом завдання досягається тим, що у способі визначення кількості ліпідів в біологічних об'єктах при проведенні гістологічних і гістохімічних досліджень, що включає зафарбовування гістозрізів спеціальними барвниками, згідно винаходу паралельно з проведенням гістологічних і гістохімічних досліджень на наявність і локалізацію ліпідів в тканинах і клітинах, частину біологічного об'єкту зважують до і після висушування, екстрагують ліпіди органічними екстрагентами, знову висушують та зважують і розраховують кількісний вміст ліпідів в сухій речовині біологічного об'єкту за формулою Лср=(m 2–m 3)·100/m 2, а вміст ліпідів в біологічному об'єкті визначають за формулою Лтк =(m 2–m 3)·100/m 1, де: Лср - вміст ліпідів (у %) в сухій речовині біологічного об'єкту; Лтк - вміст ліпідів (у %) в тканинах біологічного об'єкту; m 1 - маса біологічного об'єкту до висушування; m 2 - маса висушеного біологічного об'єкту; m 3 - маса висушеного біологічного об'єкту після екстракції ліпідів. Для одержання всебічних і об'єктивних даних, що характеризували б фізіологічний або патологічний процес при проведенні патоморфологічних досліджень, не існує методу за яким можливо встановити наявність і локалізацію різних ліпідів і одночасно визначити їх кількість в клітинах і тканинах. З гісто хімічними методами виявлення ліпідів спільне полягає в тому, що використовуються ті ж способи зафарбовування зрізів, які дозволяють якісно підтвердити наявність ліпідів і визначити їх локалізацію. Відмінність полягає у кількісному визначенні вмісту ліпідів в сухій речовині і в біологічному об'єкті в цілому у відсотках. Запропонований спосіб дозволяє виявити наявність і локалізацію ліпідів в клітинах і тканинах і визначити їх кількість (у відсотках) при проведенні звичайних гістологічних досліджень, а при проведенні гістохімічних досліджень не тільки виявити наявність і локалізацію ліпідів, але і визначити їх кількість (у відсотках). Для гістохімічного виявлення загальних ліпідів використовується зафарбовування зрізів Суданом чорним В. Хід зафарбовування за Лізоном: 1. Заморожені зрізи промивають у дистильованій воді. 2. Занурюють у 70%-ний етанол на 30с. 3. Переносять у насичений розчин судана чорного В на 70%-ному етанолі на 5-30хв. 4. Промивають у 30% етанолі. 5. Занурюють у дистильовану воду. 6. Заключають у гліцерин або гліцерин-желатину. Результат: ліпіди зафарбовуються у чорно-сірий колір. Відібраний для досліджень шматочок будь-якого органу або тканини біологічного об'єкту після фіксації у 10%ному нейтральному розчині формаліну ділять на дві частини. Першу частину шматочка зважують на аналітичних вагах (m 1), після чого висушують у сушильній шафі при температурі +105°С до постійної маси і знову зважують на аналітичних вага х (m 2). Потім цю частину шматочка для видалення ліпідів послідовно проводять через спирти зростаючої концентрації (70°, 80°, 96°, 100°), витримуючи шматочок в кожному спирті по 12-24 год., і через один із розчинників ліпідів (хлороформ, ксилол, толуол, бензол). В хлороформі шматочок витримують 24-48 год., а в інших розчинниках - 1-6 год, в залежності від тканини і розмірів шматочка. Після цього зразок висушують у сушильній шафі при температурі +105°С до постійної маси і зважують на аналітичних вага х (m 3). Вміст ліпідів у відсотках в сухій речовині (Лср) біологічного об'єкту визначають за формулою: Лср=(m 2-m 3)·100/m 2 (1) Вміст ліпідів у відсотках в біологічному об'єкті (Лтк ) визначають за формулою: Лтк =(m 2-m 3)·100/m 1 (2) Для гістологічних досліджень другу частин у шматочка промивають проточної водопровідною водою 12-24 год., зневоджують при кімнатній температурі у серії спиртів зростаючої концентрації (60%, 70%, 80%, 96%, 100%), витримуючи у кожній порції 24 год., після чого переносять у хлороформ на 24 год. Потім частину шматочка витримують у 2-х порціях рідкого парафіну при 56°С по 30-45хв. в кожній, переносять у паперову формочку, заливають рідким парафіном температурою 56°С і охолоджують. З одержаного зразка на мікротомі виготовляють зрізи, переносять їх на предметні скельця і зафарбовують гематоксиліном і еозином. Хід зафарбовування: 1. Зрізи депарафінують у ксилолі 3-5хв. 2. Витримують у 96% спирті 3хв. 3. Витримують у 70% спирті 3хв. 4. Промивають у дистильованій воді 3хв. 5. Переносять у гематоксилін на 3-5хв. 6. Занурюють у водопроводну воду до посиніння зрізу. 7. Промивають у дистильованій воді 3хв. 8. Зафарбовують 0,1%-ним водним розчином еозину. 9. Занурюють у дистильовану воду. 10. Витримують у 70% спирті 3хв. 11. Витримують у 96% спирті 3хв. 12. Витримують у ксилолі 5хв. 13. Заключають у канадський бальзам під покривне скельце. Наявність ліпідів в клітинах і тканинах і їх кількість (у відсотках) визначають за формулою 2. Локалізацію ліпідів виявляють за наявністю характерних порожніх вакуоль і включень в клітинах і тканинах (ліпіди вимиваються спиртами, а також ксилолом, хлороформом та іншими розчинниками, які використовуються при заливці шматочків у парафін). При проведенні гістохімічних досліджень з другої частини шматочка одержують заморожені зрізи, які зафарбовують за Лізоном. Наявність ліпідів в клітинах і тканинах і їх кількість (у відсотках) визначають за формулою 2. Локалізацію ліпідів в клітинах і тканинах виявляють за характерним зафарбовуванням. Приклад виконання. Відібраний для досліджень шматочок печінки фіксуємо у 10%-ному нейтральному розчині формаліну і ділимо на дві частини. Першу частину шматочка зважуємо на аналітичних вагах. Одержуємо значення його маси 5,247г(m 1). Після цього цю частину висушуємо у сушильній шафі при температурі +105°С до постійної маси і знову зважуємо на аналітичних вага х. Одержуємо значення маси 1,1029(m 2). Потім цю частину шматочка для видалення ліпідів послідовно проводимо через спирти зростаючої концентрації (70°, 80°, 96°, 100°), витримуючи шматочок в кожному спирті по 24 год., і переносимо на 48 год. в хлороформ. Після цього зразок висушуємо у сушильній шафі при температурі +105°С до постійної маси і зважуємо на аналітичних вага х. Одержуємо значення маси 1,0037(m 3). Вміст ліпідів у відсотках в сухій речовині біологічного об'єкту визначаємо за формулою (І): Лср=(1,1029-1,0037)×100/1,1029=8,995% Вміст ліпідів у відсотках в біологічному об'єкті визначаємо за формулою (2): Лтк =(1,1029-1,0037)×100/5,247=0,48% Для гістологічних досліджень другу частин у шматочка промиваємо проточної водопровідною водою 12 год., зневоджуємо при кімнатній температурі у серії спиртів зростаючої концентрації (60%. 70%, 80%, 96%, 100%), витримуючи у кожній порції 24 год., після чого переносимо у хлороформ на 24 год. Потім цю частину шматочка витримуємо у 2-х порціях рідкого парафіну при 56°С по 45хв в кожній, переносимо у паперову формочку, заливаємо рідким парафіном температурою 56°С і охолоджуємо. З одержаного зразка на мікротомі виготовляємо зрізи, переносимо їх на предметні скельця і зафарбовуємо гематоксиліном і еозином. Хід зафарбовування: 1. Зрізи депарафінуємо у ксилолі 5хв. 2. Витримуємо у 96% спирті 3хв. 3. Витримуємо у 70% спирті 3хв. 4. Промиваємо у дистильованій воді 3хв. 5. Переносимо у гематоксилін на 3хв. 6. Занурюємо у водопровідну воду до посиніння зрізу. 7. Промиваємо у дистильованій воді 3хв. 8. Зафарбовуємо 0,1%-ним водним розчином еозину. 9. Занурюємо у дистильовану воду. 10. Витримуємо у 70% спирті 3хв. 11. Витримуємо у 96% спирті 3хв. 12. Витримуємо у ксилолі 5хв. 13. Заключаемо у канадський бальзам під покривне скельце. В гепатоцитах виявляються порожні вакуолі і включення. Ліпідна природа видалених розчинниками речовин підтверджена дослідженням першої частини шматочка, а також встановлено процентний вміст ліпідів в сухій речовині і в тканинах печінки в цілому. При проведенні гістохімічних досліджень з другої частини шматочка одержуємо заморожені зрізи, які зафарбовуємо за Лізоном: 1. Заморожені зрізи промиваємо у дистильованій воді. 2. Занурюємо у 70%-ний етанол на 30с. 3. Переносимо у насичений розчин судана чорного В на 70%-ному етанолі на 30хв. 4. Промиваємо у 30% етанолі. 5. Занурюємо у дистильовану воду. 6. Заключаемо у гліцерин. Ліпіди в цитоплазмі гепатоцитів зафарбовуються у чорно-сірий колір. Крім визначення наявності і локалізації ліпідів в гепатоцитах, встановлено їх процентний вміст в сухій речовині і в тканинах печінки вцілому. Запропонований нами спосіб дозволяє виявити наявність і локалізацію ліпідів в клітинах і тканинах і визначити їх кількість (у відсотках) при проведенні звичайних гістологічних досліджень, а при проведенні гістохімічних досліджень не тільки виявити наявність і локалізацію ліпідів, але і визначити їх кількість (у відсотках).