Спосіб розпізнавання міксоми серця

Спосіб розпізнавання міксоми серця шляхом імунопстохімічного аналізу клітин пухлини, який відрізняється тим, що визначають імунофенотип клітин зазначеної міксоми серця із використанням Винахід відноситься до медицини, зокрема до онкоморфологм, і може бути використаний при визначенні клітинного походження пухлин серця Міксоми серця (МС) є доброякісними новоутвореннями Вони складають від 66 до 9 1 % всіх первинних пухлин серця і 77 - 93% доброякісних пухлин цієї локалізації Однак, незважаючи на доброякісну пухлинну природу МС, через їх внутрішньосерцеву локалізацію природний перебіг практично у всіх випадках призводить до смерті хворого, що обумовлюється незворотними змінами гемодинаміки Інтенсивний розвиток технічних засобів отримання діагностичних зображень в кардіологи, а також прецизійна сучасна техніка хірургічних втручань призвели до накопичення значної КІЛЬКОСТІ спостережень міксом серця Досягнуто значних успіхів у діагностиці та хірургічному лікуванні цих пухлин Детально вивчена описова морфологія, але проблема гістогенезу цієї пухлини залишається відкритою і, згідно з міжнародною класифікацією пухлин, міксоми серця все ще належать до пухлин неясного генезу Тому визначення клітинної належності МС серця є вкрай актуальною проблемою Для визначення клітинного походження пухлин найбільш інформативними в онкоморфологм є імуНОПСТОХІМІЧНІ технології Імунопстохімічне дослідження базується на моноклональному типуванні, де завдяки специфічній спорідненості антигена та моноклональних антитіл проти клітин мезенхіми (антивіментин), ендотелюцитів всіх типів (анTHCD31 і антиСО34) та анпотензин-конвертуючого ензиму (антиСО143), ЯКИЙ використовують як дискрімшатор судинного та ендокардіального ендотелію, і по наявності судинного ендотеліального імунофенотипу vim+CD31 +CD34+CD143+ у клітинах всіх пухлин та ендокардіального ендотеліального імунофенотипу vim+CD31 +CD34+CD143тільки в клітинах висилки гладких компактних пухлин діагностують міксому серця антитіла і утворюються імунокон югати антигенантитіло", що сприймає певний хромогенний субстрат, який дозволяє візуально реєструвати антигенну детермінанту Для визначення гістогенезу пухлин, зокрема, судинного генезу, більш обгрунтованним є одночасне використання декількох маркерів клітинного диференціювання, що забезпечує більш достовірні результати Авторські ГІСТОЛОГІЧНІ дослідження морфології міксом серця, результати яких свідчать про трансформацію судинного ендотелію у МІКСОМНІ клітини, та сучасні досягнення у галузі імунопстоХІМІЧНИХ технологій є підґрунтям для вибору панелі антитіл, запропонованої у даному винаході Наявність у серці двох типів ендотелію (ендокардіального та судинного) викликало необхідність використання при дослідження міксом серця моноклональних антитіл, які можуть бути дискрімінаторами судинного та ендокардіального ендотелію Такими є моноклональні антитіла до анпотензин-ковертуючого ензиму (анти CD 143), який продукується ендотелюцитами м'язових артерій та артеріол, тоді як ендотелюцити вен є імунонегативними [Franke F Е , Reuter S S , Metzger R et al Angiotensm-l-converting Enzyme in the Human Body // Path Res and Pract 1995, 191/7 - 8 ] Це дозволяє у певних випадках використовувати даний маркер для ідентифікації клітин, що походять із артеріальних ендотелюцитів Відомий також спосіб дослідження міксом сер 00 (О (О 46684 значення тканинної належності МС, перший шар ця шляхом імунопстохімічного аналізу клітин пухутворюється мишачими моноклональними антитілини, в якому ендотеліальні маркери використолами до віментину (antivimentm), ендотелію як сувують для вивчення клітин міксом лівого передсединного, так і ендокардіального типу (CD31, рдя серця [Parrell D J, Bulmer Р , Angus В and CD34), АСЕ судинного ендотелію (CD143) Другий Ashcroft N Immuno-hystochemical expression of шар формувався за рахунок кролячих моноклонаendothehal markers in left atnal myxomas a study of льних антитіл до мишачих імуноглобулінів (LINK) six cases Histopathology, 1996, 28, 147 -152] Ці антитіла при їхній надлишковій концентрації Даний спосіб однак не дає можливості віддивідносно антитіл першого шару відігравали роль ференціювати судинний ендотелій від ендокардіамістка-зв'язку між першим і третім шарами Третій, льного ендотелію останній шар був утворений комплексом АРААР Задачею, поставленою при створенні даного (ал кал і нфосфатаза-антиал кал інфосфатаза), що винаходу, є розробка способу розпізнавання мікявляє собою з'єднувальні локуси алкалінфосфатасоми серця шляхом імунопстохімічного аналізу зи з мишачими антитілами проти алкалінфосфатаклітин зи Таке послідовне "нанизування" моноклональПоставлена задача вирішується тим, що в них антитіл забезпечувало імунний зв'язок способі розпізнавання міксоми серця шляхом імуостаннього шару з антигеном пухлини Візуалізація нопстохімічного аналізу клітин пухлини, згідно з цього кінцевого зв'язку виконувалася за допомовинаходом, визначають імунофенотип клітин загою хромогенного субстрату, який мав споріднензначеної міксоми серця із використанням монокність із алкалінфосфатазою лональних антитіл проти клітин мезенхіми (антивіментин), ендотелюцитів всіх типів (антиСОЗІ і Робочий розчин антитіл готують на середовиантиСО34) та анпотензин-конвертуючого ензима щі RPMI 1640 (Life Technologies, Scotland) Розве(антиСО143), ЯКИЙ використовують як дискримінадення підбирають утому діапазоні, який рекоментор судинного та ендокардіального ендотелію, і по дується фірмами-виробниками (див таблицю) наявності судинного ендотеліального імунофеноВоно вважається оптимальним, якщо після завертипу клітин міксом серця vim + CD31 + CD34 + шення імунопстохімічної процедури в препаратах CD143 + та ендокардіального ендотеліального реєструються чітко пофарбовані імунопозитивні імунофенотипу vim + CD31 + CD34 + CD143 - тільструктури і відсутність неспецифічне пофарбоваки у клітинах вистілки гладких компактних новоного фону утворень, пухлину діагностують як міксому серця Спосіб здійснюють наступним чином Тканинні зразки пухлини фіксують у 10% розчині нейтрального формаліну не більше доби Наступним етапом є ретельне промивання в проточній воді з метою запобігання артефактів, пов'язаних з неповним видаленням формаліну Потім шматочки зневоднюють по спиртах зростаючої концентрації За загальноприйнятою методикою з тканинних зразків виготовляють парафінові блоки, з яких отримують зрізи товщиною 1 - 2мкм з попередньою обробкою предметних скелець поліL-ЛІЗІНОМ для більш міцної фіксації зрізів Підготовлені зрізи депарафінують у ксилолі за загальною методикою Потім послідовно обробляють в ацетоні та в суміші ацетон-трис-буфер(1 1, 0,01 молярний розчин трис-буферара рН = 7,4 7,6) Після ретельного промивання всіх препаратів у трис-буфері препарати обробляють у мікрохвильовій печі в середовищі 0,1 молярного розчину цитрату-буфера рН = 6,0 Рекомендований режим мікрохвильової процедури два рази по 5хв , потужність 600W ДОЦІЛЬНІСТЬ такої обробки обумовлюється необхідністю попереднього вивільнення антигенних детермінант після формалінової фіксації, що сприяє "зшиванню" білкових молекул за рахунок утворення внутрішньомолекулярних зв'язків, ЯКІ ускладнюють бюдоступ моноклональних антитіл до антигенів пухлини Основний етап імунопсТОХІМІЧНОІ процедури містить поетапну обробку тканинних зразків моноклональними антитілами У цьому способі використовують метод "сендвіча", що являє собою багаторівневу систему моноклональних антитіл, взаємодіючих у визначеному порядку Як показано на схемі, що додається, взаємодії моноклональних антитіл, які використані для ви Таблиця Рекомендована панель моноклональних антитіл № 1 2 3 4 5 6 Назва МкАТ Anti-Vimentm (clone V9) CD31 (clone JC 70/A) CD34 (clone Q Bend 10) CD143 (clone CG21193-36-18) Rabbit Anti-Mouse Ig (LINK) APAAP Фірма Розведення DAKO 1 200 DAKO 1 100 Dianova 1 100 DAKO 1 200 DAKO 1 40 DAKO 1 50 Технологічний процес обробки зрізів AT проводився в темній вологій камері при кімнатній температурі Час інкубації відповідав рекомендаціям фірм - розробників AT Кожний етап імунопстохімічної процедури завершувався триразовим промиванням зрізів у робочому розчині трис-буферу з метою ретельного відмивання AT для виключення неспецифічної реакції Завершальний етап імунопстохімічної реакції полягав у виявленні продукту реакції — алкалінфосфатази за допомогою складної хромогенної суміші при рН = 9,75 у режимі беззупинного перемішування протягом 20хв До складу суміші, використовуваної нами, входять левамізол, новий фуксин, альфа-нафтол та ш Додаткові компоненти дозволяють виявити алкалінфосфатазу завдяки її яскраво-червоному забарвленню Для визначення локалізації АГ у визначених структурах тканинних зрізів препарати фарбують гемалауном протягом 1 хв У завершенні всієї процедури з метою уникнення взаємодії продуктів реакції в органічних роз 5 46684 6 чинниках проводять заключения зрізів у Glycergel міксомних клітин Виявлення зазначених вище (DAKO) імунофенотипів у клітинних структурах пухлини Переважна більшість клітин МС характеризузапропонованим способом дозволяє визначити ється судинним ендотеліальним імунофенотипом судинний ендотеліальний генез міксом серця і дає vim + CD31 + CD34 + CD143 + І тільки клітини виможливість віддиференціювати міксоми серця від стілки щільних міксом серця мають ендокардіальпухлин серця іншого клітинного походження, що ний ендотеліальний імунофенотип vim + CD31 + розширює арсенал морфологічних можливостей у CD34 + CD143 діагностиці пухлин серця Отже спосіб дозволяє виявити імунофенотип ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044) 456 - 20 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71