Спосіб одержання фідерних клітин яйцепроводів

Спосіб одержання фідерних клітин яйцепроводів, який включає механічне подрібнення фрагментів тканини, відмивання клітин у середовищі, культивування їх у розчині трипсину, центрифугу 3 клітин яйцепроводів, що забезпечує дозрівання ооцитів корів до 93%, відновлює мітотичне дроблення ембріонів та підвищує їх якість на 10-15%. При проведенні патентно-інформаційного пошуку заявником і авторами винаходу знайдено технічне рішення, яке містить найбільшу кількість ознак, спільних із заявленим способом (культивуванні культури клітин яйцепроводів, обробці клітин трипсином, центрифугуванні гомогенату культури клітин) (S.Woldesenbet, G.R.Newton Comparison of proteins synthesized by polarized caprine oviductal epithelial cells and oviductal explants in vitro // Theriogenology. - 2003. - Vol.60 (3). - P. 533-543). Однак, наявність зазначених, спільних з прототипом суттєвих ознак недостатньо для одержання технічного результату, який забезпечує заявлений спосіб. Технічних рішень, які б за сукупністю ознак повністю співпадали з заявленим технічним рішенням - не виявлено. Це дозволяє зробити висновок про відповідність заявленого технічного рішення критерію корисної моделі - "новизна". В патентній і науково-технічній інформації не знайдено технічних рішень, в яких були б описані відомості про ознаки що відрізняють заявлений спосіб від прототипа і забезпечують досягнення технічного результату: шляхом збільшення кількості обробки зразків гомогенізованих тканин 0,5% розчином трипсину та ресуспендуванням клітинної маси. Отже, заявлене технічне рішення не випливає явним чином з рівня техніки, що дозволяє зробити висновок про його відповідність критерію корисної моделі - "винахідницький рівень". Корисна модель може бути застосована в біотехнологічних і трансплантаційних центрах, у дослідницьких центрах репродуктивної біотехнології тварин для регенерації та відновлення мітотичного дроблення ембріонів при їх багаторазовій бісекції, одержанні клонів тварин при економічно вигідних витратах. Таким чином, заявлене технічне рішення є новим, промислове придатним і має винахідницький рівень, тобто відповідає усім умовам патентоспроможності корисної моделі відповідно до ст.7 розділу II закону України "Про охорону прав на винаходи і корисні моделі" №1771-III, 2000р. Для підвищення життєздатності та потенціалу розвитку ооцитів та ембріонів ранніх доімплантаційних стадій нами досліджено різні способи одержання фідерних клітин яйцепроводу з визначенням їх проліферативного росту. Як контроль був вибраний спосіб одержання фідерних клітин яйцепроводу за Voelkel S.A., .et al 1985, який полягає у наступних послідовних процедурах: 1. Культивування шматочків тканини (до 2мм) впродовж 2 тижнів. 2. Обробка клітин трипсином (0,05% трипсина у збалансованому солевому розчині Хенкса). У 1-шій дослідній групі фідерні клітини яйцепроводу одержували згідно наступної схеми за S.Woldesenbet, 2003: 1. Епітеліальні клітини яйцепроводів отримували від кожного з сегментів яйцепроводу - ампульної, істмусної ділянок шляхом зішкрібування, 47452 4 механічно подрібнювали та поміщали в культуральні флакони. 2. Відокремлені клітини культивували в середовищі DMEM:F12 з вмістом 5% (1:1) бичачий сироватковий альбумін (БСА). 3. Клітини відмивали HBSS, видаляли з культуральних флаконів та піддавали короткотривалому впродовж 10 хвилин культивуванню у розчині трипсину/етилендиамінтетраоцтова кислота (ЕДТА) (1:1). 4. Життєздатність отриманих клітин яйцепроводу визначали шляхом фарбування клітин трипановим синім. 5. Клітини культивували в 12-лункових культуральних планшетах. Середовище змінювали кожні 48 годин до формування стійкого моношару клітин яйцепроводів. 6. Визначення концентрації клітин проводили в камері Горєва. У 2-й дослідній групі одержували культуру клітин яйцепроводів згідно модифікованого нами способу, що полягає в послідовній трьохразовій обробці зразків гомогенізованих тканин розчином трипсину з наступним центрифугуванням та дозволяє отримати культуру фідерних клітин з високою життєздатністю та проліферативною активністю: 1. Для одержання культури фідерних клітин використовують яйцепроводи від евтанованих тварин відразу після їх забою на м'ясокомбінаті. 2. Тканина яйцепроводів механічно подрібнюється ножицями та після додавання середовища ТМ-199 у співвідношенні 1:1 гомогенізується у скляному гомогенізаторі. 3. Отриману суспензію клітин фільтрують через 4 шари марлі. 4. Відокремлення пошкоджених нежиттєздатних клітин проводять шляхом дворазового ресуспендування клітинної маси у 2мл культурального середовища DMEM з наступним центрифугуванням впродовж 10хв при 1000об/хв. 5. Після останнього центрифугування осад дезагрегується 0,5% розчином трипсину/ЕДТА (1:1) та культивується 25 хвилин при 37°С. 6. Для відмивання від трипсину до суспензії додають середовище DMEM та центрифугують 10 хвилин при 1000об/хв. 7. Супернатант відбирають і для нейтралізації трипсину ще раз додають середовище DMEM з БСА та центрифугують 2хв при 1000об/хв. 8. Для проведення повторної трипсинізації до центрифугату додають 0,5% розчин трипсину/ЕДТА (1:1) та культивують знову 25 хвилин при 37°С. 9. Відмивання від трипсину та нейтралізацію його DMEM проводять аналогічно пункту 5 і 6. 10.Третю трипсинізацію, відмивання і нейтралізацію трипсину здійснюють згідно пункту 4.5 та 6. 11. Одержані три групи клітин змішують, ресуспендують і проводять визначення концентрації клітин в камері Горяєва в 5-ти великих квадратах по формулі: C=n*12,5*1000, де n - число клітин в 5-ти квадратах 5 47452 12. У стерильні чашки з культуральним середовищем (V=200мкл) додавали отримані ізольовані клітини яйцепроводів і культивували впродовж 24-х годин при t=38,5, в атмосфері з 5% CO2. Використовують первинну культуру клітин яйцепроводів в концентрації 1´106 клітин/мл середовища. В результаті проведених досліджень встановлено, що завдяки застосуванню трьохкратної трипсинізації тканини яйцепроводів при одержанні первинної культури збільшується в 2,5 рази вихід ізольованих клітин яйцепроводів (1-ша дослідна група) за рахунок поетапного відщеплення клітин 6 від конгломератів тканини. Одержані клітини 1-шої дослідної групи по життєздатності та проліферативній активності не відрізняються від клітин одержаних шляхом однократної трипсинізації (табл.) через те, що відділені клітини не піддаються дії трипсину. Приклади конкретного використання способу Для перевірки технології та підтвердження переваги заявленого способу перед відомими нами досліджено ефективність різних способів отримання культури фідерних клітин яйцепроводу. Таблиця Результати одержання фідерних клітин яйцепроводів трьома способами, M±m, n=3 Групи Контрольна Прототип Модифікований спосіб Кількість клітин в 1мл (´106), через 24, 48 та 72 години культивування початкова 24 48 72 1,2 3,85±0,03 4,89±0,03 6,62±0,05 1,2 4,44±0,38 5,05±0,03 8,46±0,05 1,2 3,55±0,10 4,97±0,04 15,93±0,04 Порівняння результатів досліджень способів одержання фідерних клітин яйцепроводу заявленого модифікованого способу з традиційними способами свідчить про те, що найбільш ефективним виявився заявлений спосіб одержання фідерних клітин яйцепроводів. Послідовна трьохразова обробка зразків гомогенізованих тканин розчином трипсину з наступним центрифугуванням (Модифікований спосіб) Комп’ютерна верстка М. Ломалова дозволяє отримати культуру фідерних клітин з високою життєздатністю та проліферативною активністю з 1,21´106 до 15,93±0,04´106 після 72 годин культивування, тоді як в прототипі концентрація клітин після тривалого культивування становила 8,46±0,05´106, а в контрольній групі відповідно - 6,62±0,05´106. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601