Спосіб очищення білкових розчинів від патогенної форми пріонового білка

Спосіб очистки білкових розчинів від патогенної форми прюнового білка, що включає хромато графічне розділення окремих компонентів білкової суміші, який відрізняється тим, що розчин очищуваного білка піддають контакту з малоімуногенною поверхнею з показником гідрофільності - кутом змочування речовини водою у повітряному середовищі 8 - в діапазоні від 42° до 127° С Винахід відноситься до медицини, бютехнологм, харчової, фармацевтичної та парфумерної промисловостей та може бути використаний метою запобігання інфікуванню та очищення білкових препаратів та білкової сировини від інфекційного агенту групи нейродегенеративних спонпформних енцефалопатій - так званої патогенної форми прюнового білка (PrPSc)[1] Відомо, ЩО нормальна клітинна форма прюс нового білка (РгР ) синтезується у нервових клітинах ссавців та підлягає швидкій деградації позаклітинними протеїназами [1] Патогенна форма прюнів відрізняється від нормальної лише за способом укладки поліпептид ного ланцюгу [2] та спричиненими цією ВІДМІНОЮ фізико-хімічними та біохімічними властивостями, зокрема - малою імуногенністю, високою СТІЙКІСТЮ до дії денатураційних чинників та протеолітичних ферментів [3, 4] Патогенній формі притаманна також висока спорідненість (адгезія) до металевої поверхні, що призвело до масового інфікування інрацеребральними внутрішньо-мозковими електродами, попередньо використаними для обстеження та лікування інфікованої людини [5,6] Мала мінімальна інфекційна доза патогенної форми прюнового білку [7], и здатність до акумуляції [8], а також нещодавно доведена здатність інфікування людей прюнами тваринного походження [9, 10] за умови відсутності придатних до масового вжитку високочутливих аналітичних методів [11] спричинили до заборони на використання цілого ряду видів білкової сировини тваринного та донорного походження, а також до істотного обмеження застосування ВІДПОВІДНИХ білкових препаратів у медицині, бютехнологм, фармацевтичній та парфумерній промисловостях [12] Останнім часом з метою позбавлення білкових препаратів від домішки прюнового білка та запобіганню можливому інфікуванню білковими препаратами тваринного та донорного походження розробляються методи, основані на йонобмінній хроматографії [13] Подібні методи є практично непридатними до застосування у бютехнологм, фармацевтичній та парфумерній промисловостях, оскільки принципово не здатні забезпечити повне захоплення прюнового білка, в особливості за його доведеної здатності утворювати асоціати з іншими білками [14] Задача запропонованого винаходу полягає в розробці придатного до промислового використання способу очищення білкових препаратів та білкової сировини від патогенної форми прюнового білка В якості прототипу вибрано хроматографічний йонобмінний метод відокремлення патогеної форми прюнового білка з мікросомальної фракції екстрактів нервових тканин прюн-інфікованих ховрахів [13] Спосіб-прототип полягає в двостадійній йонобмінній хроматографії екстрактів досліджуваного матеріалу з подальшим визначенням інфекційної дії білка до та після хроматографічних процедур Недоліки способу-прототипу полягають в його обмеженій придатності до бютехнолопчного застосування через високу вартість та довготривалість проведення подвійної йонобмінної хроматографії, складність виконання методу та відсутності принципової гарантії від проходження інфекційного 00 (О 47698 агенту, зокрема - в формі асоціатів з іншими білками очищуваного препарату Поставлена задача досягнута завдяки використанню відомої та притаманної всім без винятку видам патогенної форми прюнового білка властивості - виключно високої адгезії до гідрофобних поверхностей як наслідку формування характерної конформації PrP Sc внаслідок взаємодії неструктурованої білкової молекули з подвійним гідрофобним шаром клітинних мембран (так званого мембранного фолдингу [15]) Повна сорбція PrP Sc досягається за рахунок пропускання білкового розчину через шар сорбенту з розвиненою малоімуногенною поверхнею з показником гідрофільності кутом змочування речовини водою у повітряному середовищі 0 в діапазоні від 42° до 127°С, зокрема - металевою або металізованою, або тривалого зберігання білкового розчину у посуді, виготовленому з матеріалу з аналогічним показником гідрофільності Спільними ознаками способу-прототипу та способу, що заявляється, є застосування хроматографічної процедури - розділення окремих компонентів білкового розчину за рахунок їх вибіркового зв'язування з нерозчинною сорбуючою поверхнею Спосіб виконується згідно наведених прикладів Приклад 1 Інфекційний матеріал Гомогенат головного мозку інфікованих BSEпозитивних мишей готували згідно [17] в 0 5 М розчині хлориду натрію в 0 05 М трис-солянокислому буфері, що містив 0 01 М хлориду кальцію, рН 7 4 (робочий буфер) за співвідношення 1 5 (вага об'єм) Відокремлювали осад центрифугуванням при ЗОООд протягом 20 хвилин, супернатант піддавали ультрафільтрації через мембрану з 5мкм отворами та розводили тим же буфером Загальний вміст розчиненого білка визначали за методом Лоурі [16] Приклад 2 Визначення прюнового титру Вміст PrP Sc визначали за допомогою стандартного іммуноферментного набору BioRad [17] за ВІДПОВІДНОГО розведення досліджуваних зразків до та після процедури очистки Приклад 3 Процедура очистки (хроматографічний метод) 200мл розведеного в 1000 разів робочим буфером екстракту наносили на урівноважену тим же буфером заповнену сорбентом з показником гідрофільності поверхні - кутом змочування речовини водою у повітряному середовищі Э - в діапазоні від 42° до 127° - хроматографічну колонку діаметром 1 7см та довжиною 30см зі швидкістю 45мл на годину Промивали колонку 75мл того ж буферу та визначали сумарну КІЛЬКІСТЬ елюйованого білку та його прюновий титр Встановлено, що зменшення сумарної КІЛЬКОСТІ білка не піддається реєстрації методом Лоурі, тоді як рівень PrP Sc зменшився до рівня, що не піддається реєстрації за допомогою набору BioRad, тобто логарифм ступеню очистки перевищує 5 Приклад 4 Процедура очистки (сорбція на стінках посуду) 2000мл приготованого аналогічно Прикладу З розчину повільно перемішували протягом трьох діб за температури 5°С у посуді з неіржавіючої сталі Встановлено, що сумарна КІЛЬКІСТЬ білка лишилася незмінною, тоді як логарифм ступеню очистки від PrP Sc знаходиться у межах 4 3 - 4 7 Наведені приклади свідчать, що запропонований спосіб забезпечує високу ступінь очистки білкових розчинів від домішки патогенної форми пріонового білка і є придатним до промислового застосування з метою запобігання інфікування та очищення білкових розчинів від інфекційних агентів прюнового типу Список посилань 1 Prusmer S Molecular biology of pnon disease //Science -1991, 14 June -252-P 1515-1522 2 Pan К, Baldwin M , Nguyen J et al Conversion of a-hehces into p-sheets features in the formation of the scrapie pnon protein // Proc Natl Acad Sci USA - 1993 - 90, N 23 - P 10962-10966 3 McKmley M , Bolton D , Prusmer S A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie pnon//Cell -1983 - 35, N 1 -P 57-62 4 Kocisco D , Come J , Pnola S et al Cell-free formation of protemase-resistant pnon protein // Nature -1994 -370 -P471 -474 5 Brown P , Preece M , Will R "Friendly fire" in medicine hormones, homografts, and CreutzfeldtJakob disease // Lancet - 1992 - 340, N 8810 -P 24 -27 6 Bernoulli С , Siegfried J , Baumgartner G , et al Danger of accidental person to person transmission of Creutzfeldt-Jakob disease by surgery // Lancet -1977 -1, N8009 -P 478 - 479 7 Riesner D Pnons and their biological background//Biophys Chem -1997 -66-P 259-268 8 Веревка С Прионы и белковые ингибиторы сериновых протеиназ структурные аналогии и их следствия II О динамике прионовых заболеваний // Укр биохим журн - 2000 - 721, N 6 - С 96 -102 9 Hoyle R The link between Creutzfeldt-Jakob disease and BSE // Nature Biotechnology - 1997 15, N 4 -P295 10 European Comission in Oral Exposure of Humans to the BSE Agent Infective Dose and Species Baner - Scientific Steering Committee Meeting, 13-14 April 2000 11 Moynagh J , Schimmel H Tests for BSE evaluated//Nature -1999, 8 July -P 105 12 Fatal Protein The Story of CJD, BSE and Other Pnon Diseases / by R Ridley and H Baker, Oxford University Press, 1998, 249 p 13 Uren E Klemig M , Thomas P , Goss N Partitioning of PrP c in the chromatographic process of plasma derived proteins // Plasma Product Biotechnology Meeting 2001 - May 14th - 17th 2001, Radisson SAS Bay Point Resort, Malta -P 55 14 Fischer M , Roecki С , Panzek P et al Binding of disease-associated pnon to plasminogen // Nature - 2000,28 November - 408 - P 479 - 483 15 Веревка С Прионы и серпины структурные аналогии и их следствия I Протеиназотранспортная гипотеза // Укр биохим журн - 1999 - 7 1 , N5 -С 135-139 5 47698 16 Lowry О , Rosenbrough N , Parr A , Randall R Protein measurement with the Fohn phenol reagent//J BiolChem -1951 -193.N 1 - P 265 - 276 6 17 Deslys J , Comoy E , Hawkins S et al Screening slaughtered cattle for BSE // Nature 2001, 25 January -409 - P 476 - 478 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044) 456 - 20 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71