Спосіб оцінки біологічних ефектів речовин і матеріалів

1. Спосіб оцінки біологічних ефектів речовин і матеріалів, що включає використання запліднених курячих яєць з ембріонами, формування отворів у шкаралупі, введення усередину яйця досліджуваного об'єкта, герметизацію шкаралупи, інкубацію яєць та вилучення зародків на етапах ембріогенезу з подальшим їх дослідженням, який відрізняється тим, що використовують серію курячих яєць з 3-денними ембріонами, через сформовані у шкаралупі отвори вводять у їх жовткові мішки спеціально підготовлену речовину або матеріал, герметизують отвір, інкубують та поступово проводять серійне вилучення зародків впродовж різних термінів ембріогенезу і проводять їх дослідження. 3 Недоліками цієї моделі є її виняткове призначення для тестування окремої групи суто мікробних агентів (вірусів), до того ж з певними обмеженнями, бо багато різновидів вірусів не розмножуються на ембріонах птахів. Спосіб не розповсюджується на тестування речовин і матеріалів. Відомий також спосіб використання хоріоалантоїсної мембрани курячих ембріонів для оцінки проникаючої здатності токсичних речовин через цю структуру (див. Valdes T.Y., Rreutzer D., Moussy F. The chick chorioallantonic membrane as a novel in vitro model for the testing of biomaterials // Biomed Mater Res. - 2002. - Vol. 62, №2. - P. 273-282). Дана модель розглядається як можливість застосування хоріоалантоїсної оболонки в якості альтернативи стандартним моделям на ссавцях для вивчення відповіді на біоматеріали. Спосіб виконують наступним чином. У заплідненому курячому яйці з 4-денним ембріоном роблять отвори - маленькі «віконця» для спостереження. Через отвір вносять на хоріоалантоїсну оболонку курячого ембріона подразнюючий агент, наприклад, бавовняну нитку чи силіконову трубочку. Інкубують 8 днів , а надалі вилучають хоріоалантоїсну оболонку і проводять оцінку за клітинною відповіддю на ці матеріали, здійснюючи візуальний огляд, або використовують гістологічне дослідження чи скануючу електронну мікроскопію. Автори моделі стверджують, що відповіді на подразнення аналогічні таким у ссавців та варіюють відповідно до різновиду матеріалів, а просторова структура тестових матеріалів дуже впливає на інкорпорування зразків у хоріоалантоїсну оболонку. Недоліками цього способу є: обмеженість кількості матеріалу, який можна внести в хоріоалантоїсну оболонку; - обмеження різновидів клітинних популяцій ембріона, які вилучають для комплексних досліджень, оскільки нормальна хоріоалантоїсна оболонка містить три шари ектодерми (до шкарлупи), примітивну строму (пухка сполучна тканина) й ентодерму (до алантоїса), а її ширина становить приблизно 200нм. В основу корисної моделі покладено завдання створити такій спосіб оцінки біологічних ефектів речовин і матеріалів, який би дозволив проводити їх тестування незалежно від їх дисперсності та розчинності, в тому числі - нерозчинних, комплексно, на великій кількості клітинних популяцій, використовуючи серійність дослідження. Для вирішення завдання запропонований спосіб оцінки біологічних ефектів речовин і матеріалів шляхом введення в стерильних умовах попередньо підготовленої (простерилізованої за температури 120°С впродовж 60 хвилин речовини або матеріалу у вигляді суспензії в 0,2мл біосумісного декстрану, наприклад - реополіглюкіну) у жовткові мішки серії курячих ембріонів з третьою добою інкубації яєць з наступною герметизацією отворів і продовженням інкубації та поступовим серійним забором біологічного матеріалу у різні терміни ембріогенезу курчати з наступним їх вивченням. Термін введення досліджуваних агентів (третя 49464 4 доба інкубації) зумовлений формуванням до цього часу жовткового мішка - провізорного органа, що виконує функцію перетравлювання і всмоктування жовтка та одночасно слугує на ранніх стадіях розвитку зародка першим кровотворним органом і органом дихання, бо кровоносні судини жовткового мішка наближені до підшкарлупової оболонки. Оскільки через жовтковий мішок відбувається поглинання поживних речовин ембріоном, саме в нього є сенс вводити агенти, вплив яких на живий організм слід дослідити. Такий підхід водночас запобігає ураженню самого тіла ембріона і гарантує потрапляння в нього об'єкта дослідження. Стійкість положення жовткового шару в білкові здійснюється халазами. Можливість введення подрібнених твердих нерозчинних речовин забезпечується їх суспензією в біосумісному декстрані (наприклад - реополіглюкіні). Декстрани - полімери глюкози, які мають різні ступені полімеризації, що визначають застосування їх розчинів (гемодинамічні засоби, дезінтоксиканти). Самі декстрани є нетоксичними й екскретуються нирками в незмінному вигляді. При накопиченні в організмі декстрани метаболізуються до глюкози у клітинах ретикулярної системи. Вони біосумісні та не чинять пошкоджуючого впливу на клітинні популяції, у чому переконали дослідження на одній із груп курячих ембріонів, котрим вводили в жовтковий мішок чистий реополіглюкін (Реополіглюкін-Новофарм). При використанні такого способу досягається оцінка (у динаміці формування та розвитку різних тканин) біологічних ефектів різноманітним речовин і матеріалів, в тому числі - нерозчинних. Спосіб виконують наступним чином. У запліднених курячих яйцях з 3-денними ембріонами роблять отвори, Через отвори за допомогою шприца у жовтковий мішок вводять спеціально підготовлену речовину, наприклад, суспензію у біосумісному декстрані активованого вугілля або азбесту. Отвір герметизують, і яйця розміщують в інкубатор та витримують в інкубаційних умовах. У різні наступні терміни ембріогенезу з 6 по 20 день вилучають зародки, що разом складають серію для динамічних спостережень, і надалі проводять оцінку за тканинними відповідями на досліджувані речовини (матеріали), здійснюючи візуальний огляд, світлову та електронну мікроскопії. Приклад 1. Курячі яйця інкубують за температури 37,538,5°С та достатніх вологості повітря і вмісту в ньому кисню. Для комплексної оцінки біологічних ефектів активованого вугілля (модель ZL-302, щільність - 0,42г/см3, діаметр пор - (30-70) мкм, вміст золи - менше 4%) цей матеріал вводять на третю добу інкубації за допомогою шприца у стерильних умовах у жовтковий мішок. Доза активованого вугілля аналогічна разовій підтримуючій дозі, прийнятій у медичній практиці, тобто 1,0 г при вазі людини 70 кг у перерахунку на вагу жовтка яйця (22 г): 22,0 1:70000=0,31 (мг). Стерилізація матеріалу попередньо здійснюється за t=120°C впродовж 60 хвилин. Оскільки вводити активоване вугілля у сухому вигляді неможливо, його розводять в 0,2мл декстрану, отримуючи суспензію. 5 49464 Після введення суспензії активованого вугілля у жовтковий мішок утворений отвір заліплюють воском і після застигання останнього яйце обережно повертають до інкубатора. Забір матеріалу для подальших комплексних морфологічних досліджень здійснюють починаючи з шостої доби інкубації. На ранніх стадіях ембріогенезу забирають весь зародок, а починаючи з 15-ої доби - окремі органи і тканини. Для забору зародка шкарлупу яйця розбивають навпіл, його вміст обережно виливають у чашку Петрі, де ножицями вирізають зону навколо зародка. Далі з фільтрувального паперу вирізають кільце, зовнішній діаметр якого дорівнює діаметру навколо зародкової зони досліджуваного об'єкта, і накладають це кільце на вирізаний зародок. Фільтрувальний папір з наліпленим до нього зародком відмивають від жовтка (переносять у чашку Петрі з фізіологічним розчином) і далі занурюють у фіксатор. Його вибір залежить від подальшого скерування досліджень (світлова чи електронна мікроскопія, гісто-, лектиноімуногістохімія). У випадку забору окремих органів і тканин їх безпосередньо поміщають у фіксатор. Результати комплексної оцінки біологічних ефектів активованого вугілля показали, що введення активованого вугілля у жовтковий мішок сприяє більш швидкому росту та пришвидшеному розвитку курячих ембріонів, особливо на пізніх стадіях інкубації. На формування судинної оболонки жовткового мішка активоване вугілля суттєво не впливає. Активоване вугілля здатне проникати через клітинні мембрани та мігрувати в організмі, однак ці явища не супроводжуються патологічними реакціями. Приклад 2. Курячі яйця інкубують за температури 37,5 Комп’ютерна верстка Л. Купенко 6 38,5°С та достатніх вологості повітря і вмісту в ньому кисню. Для комплексної оцінки біологічних ефектів азбесту (серпентину, Mg6 Si4 О10 (ОН)8) цей матеріал вводять на третю добу інкубації за допомогою шприца у стерильних умовах у жовтковий мішок. Доза азбесту складає 0,31мг в 0,2мл декстрану. Розрахунок дозування аналогічний прийнятим у медико - біологічній практиці розрахункам разової підтримуючої дози активованого вугілля (0,1г при вазі людини 70кг) у перерахунку на вагу жовтка яйця (22г): 22,0 1:70000=0,31 (мг). Стерилізація матеріалу попередньо здійснюється за t=120°C впродовж 60 хвилин. Всі подальші етапи, аж до забору матеріалу включно, здійснюються за схемою, описаною в прикладі 1. Результати оцінки біологічних ефектів азбесту показали, що він володіє тератогенними властивостями, зумовлюючи високі показники загибелі, вади розвитку та численні пошкодження курячих ембріонів. Заявлена корисна модель має наступні переваги: - дозволяє оцінювати біологічні ефекти речовин і матеріалів будь-яких дисперсності та розчинності (в тому числі - нерозчинних); - забезпечує потрапляння здатних до міграцій у живому організмі речовин (матеріалів) до різних органів і тканин; - надає можливість комплексної оцінки відповіді на речовини (матеріали) великої кількості клітинних популяцій (тканин) у їх взаємодії та розвитку; - дозволяє з'ясувати найбільш уразливі тканини чи органи. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601