Спосіб моделювання гострих гнійно-деструктивних пневмоній

Спосіб моделювання гострих гнійнодеструктивних пневмоній, що включає введення в легені культур грамнегативних і (чи) грампозитивних мікроорганізмів, з наступним охолодженням тварини і виведенням її з досліду, який відрізняється тим, що введення мікроорганізмів здійснюють штратрахеально сумішшю добових культур S aureus і Е соїі і суспензією добової культури Р aerugmosa при температурі 0°С і вологості повітря 85-90% Винахід відноситься до експериментальної медицини і біологи і може застосовуватися як модель гострого гнійно-деструктивного запалення легень для відпрацьовування нових схем лікування Існуючі моделі експериментальної гострої гнійно-деструктивної пневмонії (ГГДП), які застосовуються в медичній науці, не завжди точно відображають етіологію і патогенез ГГДП, що виникають у реальних умовах Так, наприклад, відома модель [В Ф Цинзерлинг, А Ф Мороз «Сравнительная оценка патологического процесса на модели острой экспериментальной пневмонии крыс, обусловленной штаммами Pseudomonas aeragmosa различного происхождения» //ЖМЭИ -1984 - № 1 2 - С 6 8 72], у якій білих пацюків, що знаходилися під ефірним наркозом, дворазово заражали шляхом інтратрахеального введення різних кількостей мікробних клітин Перший раз збудник вводили в проводили через 24, 48 і 72 години з моменту введення скипідару В останні роки велике поширення одержала модель експериментального бактеріального запального процесу в легенях у пацюків [А Я Кожемякин, О Л Молчанов, Л А Кожемякин «Динамика эффекторных функций альвеолярных макрофагов при экспериментальном стафилококковом поражении легких у крыс» // Иммунология - 1992 - № 2 - С 2 3 - 2 7 ] Суть методу полягала в тому, що запальний процес у легенях викликали шляхом штратрахеальної інстиляції культури Staphylococcus aureus 209 Застосовували 2 схеми зараження, у кожній з який тварин за 1 годину до зараження переохолоджували при температурі - 20°С, що давало можливість одержати різні за важкістю форми патологічного процесу «Легка» форма процесу розвивалася в результаті інстиляції в трахею 0,1мл добової культури S aureus 209 (2 * 106 КУО - у 1мл суспензії) Для відтворення більш важкої форми процесу вводили 0,1 мл суспензії культури S aureus 209 (5 * 106 КУО/мл), яку отримували після 3-кратного пасажу на білих безпородних мишах Суспензія містила 25% неповного ад'юванту Фрейнда Тваринам контрольної групи штратрахеально вводили 0,1 мл стерильного ІЗОТОНІЧНОГО розчину хлориду натрію Пацюків виводили з досліду на 1, 3, 6,10 і 15-у добу К І Л Ь К О С Т І 3 , 1 2 5 * 1 0 7 , 6 , 2 5 * 1 0 , 1 2 , 5 * 1 0 \ 2 , 5 * 10 , 5,0 * 10 1,0 * 10 мікробних клітин, а повторно - 1,0 * 10 бактерій Для локалізації інфекції в легенях до суспензії мікробів (Р aerugmosa) додавали 10% ПОЛІВІНІЛОВИЙ спирт Тварин забивали на 1, 2, 3, 4 і 7-у добу після зараження Також існує модель [А М Кулик «Регуляция дыхания и легочного кровообращения при экспериментальной пневмонии» // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 1986 - № 2 С 144 - 146], де кішкам у трахею вводили 0,3мл обсмоленого скипидару, в результаті чого викликали експериментальну пневмонію Дослідження Зазначений метод (А Л Кожемякин и соавт) є найбільш близьким по технічній суті і результату, якого можна досягти, у порівнянні з тим, що заявляється нами Тому ми його беремо за прототип Відомим аналогам, утому числі і прототипові, СО (О 49634 характерні ІСТОТНІ недоліки мала наближеність до природних форм виникнення і протікання пневмоній, у реальних умовах КЛІНІЧНО «легка» форма практично не зустрічається, як і не відбувається тривалого переохолодження при настільки низьких температурах Зараження відбувається в результаті дробового введення збудника, що робить модель громіздкою і малозручною у роботі Застосування неповного ад'юванту Фрейнда приводить до високого ступеня реактогенності, алергізацм, аутоалерпзацм, індукуванню новоутворень різного генезу, а також - до порушень гомеостатичних функцій Застосування скипидару, як агента асептичного запалення, не завжди приводить до деструкції легеневої тканини й у більшості випадків веде до однобічних бронхопневмоній Таким чином, з огляду на усе вищесказане, в основі винаходу покладена задача підвищення точності моделювання ГГДП Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі моделювання ГГДП, що включає введення в легені культур грамнегативних і (чи) грампозитивних мікроорганізмів, з наступним охолодженням тварини і виведенням м з досліду, згідно винаходу, введення мікроорганізмів здійснюють штратрахеально сумішшю добових культур S aureus і Е сом і суспензією добової культури Р aerugmosa при температурі 0°С і вологості повітря 85 - 90% Моделювання виконується таким чином Беруть білих пацюків лінії Wistar у ВІЦІ 6 - 9 МІСЯЦІВ, обох статей, масою 180 - 250гр , що знаходяться в умовах стандартного лабораторного утримання і раціону харчування Експеримент проводять протягом 13 діб Усі тварини були розділені на три групи контрольну (п = 20) і дві експериментальні (п = 40) Тваринам контрольної групи штратрахеально вводять 0,1мл стерильного ІЗОТОНІЧНОГО розчину хлориду натрію Експериментальних тварин за 1 годину до зараження поміщали в камеру з вологістю повітря 85 - 90% і температурою 0°С У першій експериментальній групі зараження пацюків для відтворення запального процесу в легенях проводили шляхом штратрахеальної інстиляції сумішшю добових агарових культур S aureus (штам АТСС 209) і Е соїі (штам АТСС 25922), а в другій групі - суспензією добової агарової культури Р aerugmosa (штам АТСС 27853), по 0,1мл у КІЛЬКОСТІ 5 * 109 КУО/мл під ефірним наркозом, за допомогою штратрахеального катетера Тварин виводять з досліду на 3, 6, 10, 13-у добу Усі болючі процедури виконані ВІДПОВІДНО ДО ХЄЛЬСІНСЬКОІ декларації про гуманне відношення до тварин Розрахунок LD50 при даному способі зараження проводять по формулі І П Ашмарша й О О Воробйова (1962) У тварин роблять КІЛЬКІСНІ ВИСІВИ мікроорганізмів з легень, для чого обоє легень зважують, після цього 1 г легеневої тканини розтирають у ступці зі стерильним піском і 5мл 0,85% розчину NaCI Надалі КІЛЬКІСТЬ вирослих бактерій підраховують на обох легенях При висівах мікроорганізмів на м'ясопептонний агар виділяли S aureus, Е соїі і Р aemgmosa у КІЛЬКОСТІ 4 * 10 9 - 8 * 10 9 КУО/МЛ за куль-туральними і біохімічними властивостями ідентичні взятим для зараження Легені піддають морфологічному дослідженню, що включає макро-1 мікроскопічне вивчення При макроскопічному дослідженні легень виявлені великі вогнища деструктивного руйнування, виражене геморагічне просякання тканини легень Тканину легень для морфологічного дослідження фіксують в 10% нейтральному формаліні, депдратують, заливають в целоідин-парафін, фарбують гематоксиліном і еозином На підставі чого виявляють типові ознаки гострої гнійнодеструктивної пневмонії, що характеризується такою картиною У мікроскопічних препаратах легень відзначають у центрі вогнища пневмонії, де скопичується збудник, виникнення некротичних змін клітин і міжальвеолярних перегородок, гнійний ексудат, навколо ділянки некрозу скупчення лейкоцитів і нейтрофілів Результати обробляють із застосуванням параметричних і непараметричних критеріїв Таким чином, позитивний ефект моделі, що заявляється, полягає в тому, що вона дозволяє наблизити експериментальне зараження до природних умов виникнення захворювання, виключає вплив штучних агентів запалення і дає достовірну клінічну картину захворюваності Приклад 1 Біла пацюк-самка породи Wistar у ВІЦІ 6 МІСЯЦІВ масою 250г, що знаходилася в умовах стандартного лабораторного утримання і раціону харчування Попередньо тварину витримували при температурі 0°С і вологості повітря 85 - 90% протягом 1 години Під ефірним наркозом штратрахіально вводили суміш добових агарових культур S aureus АТСС 209 і Е coll АТСС 25922 по 0,1 мл у КІЛЬКОСТІ (5 ± 0,03) * 109 КУО/мл Пацюка вивели з досліду на 3-ю добу після зараження Для встановлення наявності пневмонії мікробіологічному і гістологічному дослідженню були піддані обоє легенів тварини Для підтвердження ідентичності мікроорганізмів, узятих до зараження і виділених з легень експериментально заражених пацюків, вивчалися їх біологічні властивості Досліджували висіви з легень на м'ясопептоному агарі і виділили S aureus і Е сом у КІЛЬКОСТІ 4 * 109 - 8 * 109 КУО/мл Було встановлено, що по морфологічним, тинкторіальним, культуральним і біохімічним властивостям виділені від заражених пацюків штами були ідентичні штамам, які застосовувалися для зараження Також легені піддавалися морфологічному дослідженню Цитологічна оцінка уражень тканини легень проводилася мікроскопією фарбованих за Рамоновським мазків, де виявлені скупчення стафілокока і кишкової палички в бронхах і в альвеолярних структурах легень пацюка, серозногеморагічний ексудат з домішками лейкоцитів і нейтрофілів У центрі вогнища пневмонії поряд з підвищеною КІЛЬКІСТЮ бактерій спостерігалися некротичні зміни клітин ексудату і міжальвеолярних 49634 перегородок, а навколо ділянки некрозу - скупчення лейкоцитів В альвеолах більш периферичної зони переважно зустрічається фібринозна ексудація, а по краю вогнища запалення - серозна, при відсутності бактерій Для ГІСТОЛОГІЧНОГО дослідження використову вали парафінові зрізи легень товщиною 5мкм, фарбовані гематоксиліном і еозином ГІСТОЛОГІЧНО В легенях виявлені повнокров'я, стази, крововиливи в просвіт і в стінки альвеол Деструкція охоплює штерстиціальні прошарки легень з залученням плеври, лімфатичних вузлів Виявлено лейкоцитарний ексудат, локалізований у бронхіолах і альвеолярній тканині, які заповнені фібрином і нейтрофілами, а по периферії лежить зона серозного набряку На підставі отриманих даних можна стверджувати про наявність гострої гнійно-деструктивної пневмонії, яка викликана S aureus і Е соїі, у даного пацюка Приклад 2 Біла пацюк-самка породи Wistar у ВІЦІ 7 МІСЯЦІВ масою 280г, що знаходилася в умо вах стандартного лабораторного змісту і раціону харчування Попередньо тварину витримували при температурі 0°С і вологості повітря 85 - 90% протягом 1 години 0,1мл суспензії добової агарової культури Р aerugmosa АТСС 27853 у КІЛЬКОСТІ (5 ±0,01) * 109 КУО/мл вводили під ефірним наркозом за допомогою штратрахеального катетера Пацюка вивели з досліду на 3-ю добу після зараження Для встановлення наявності пневмонії мікробіологічному і гістологічному дослідженню були піддані обоє легень тварини Для підтвердження ідентичності мікроорганіз мів, взятих до зараження і виділених з легень експериментально заражених пацюків, вивчалися їх біологічні властивості Досліджували висіви з легень на м'ясопептонному агарі і виділили Р aerugmosa у КІЛЬКО9 9 СТІ 4 * 10 - 8 * 10 КУО/мл Було встановлено, що по морфологічним, тинкторіальним, культуральним і біохімічним властивостям виділені від заражених пацюків штами ідентичні штамам, які застосовувалися для зараження Також легені піддавалися морфологічному дослідженню Макроскопічне легені були пперемійовані, набряклі, визначалися множинні одиночні і зливні геморагічні вогнища, ділянки гнійної деструкції Для ГІСТОЛОГІЧНОГО дослідження використову вали парафінові зрізи легень товщиною 5мкм, фарбовані гематоксиліном і еозином Морфологічне дослідження легень пацюка з експериментальною пневмонією, яка викликана штамом Р aerugmosa, на 3-ю добу після зараження показало повнокров'я і нерівномірну легкість, у просвіті альвеол - помірна КІЛЬКІСТЬ серозної рідини, серед нейтрофілів виявили одиничні мікроорганізми, що мають форму паличок Вогнища нейтрофільно-макрофагальної інфільтрації, що охоплюють велику частину площі обох легень, найбільш щільна ця інфільтрація була навколо бронхів, де спостерігалися мікронекрози окремих клітин На підставі отриманих даних можна стверджувати про наявність гострої гнійно-деструктивної пневмонії, яка викликана Р aerugmosa, у даного пацюка ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71