Ліофілізована композиція морфогенетичного фактора кістки, спосіб одержання ліофілізованої композиції морфогенетичного фактора кістки

1 Люфілізована композиція морфогенетичного фактора кістки МР52 людини, що містить суміш морфогенетичного фактора кістки МР52 людини з манітом у ваговому співвідношенні в межах 1 5-50 2 Композиція за п 1, яка відрізняється тим, що зазначений морфогенетичний фактор кістки МР52 людини одержано із застосуванням технологій генетичної інженери 3 Спосіб одержання люфілізованої композиції морфогенетичного фактора кістки МР52 людини, який полягає в доданні маніту до очищеного розчину морфогенетичного фактора кістки МР52 людини у КІЛЬКОСТІ, що забезпечує вагове співвідношення морфогенетичного фактора кістки МР52 людини і маніту в межах 1 5-50, і подальшій люфілізацм одержаного в результаті змішаного розчину 4 Спосіб за п 3, який відрізняється тим, що зазначений морфогенетичний фактор кістки МР52 людини одержано із застосуванням технологій генетичної інженери о Цей винахід стосується люфілізованої композиції морфогенетичного фактора кістки МР52 людини і процесу м приготування Більш конкретно, даний винахід стосується люфілізованої композиції, що містить морфогенетичний фактор кісток МР52 людини і маніту, та способу и одержання кДНК морфогенетичного фактора кістки МР52 людини було вперше виділено в 1994 році, визначено як така, що належить до факторів, пов'язаних з остеогенезом, і класифіковано у супер-сімейство TGF-p (Biochem Biophys Res Commun , 1994, vol 204, N 2) Потім вдосконалення методів генетичної інженери зробило можливим одержання морфогенетичного фактора кістки МР52 людини без порушення його активності з контролю морфогенезу кісток (WO 96/33215) Зберігання морфогенетичного фактора кістки МР52 людини здійснюється в люфілізованому стані Однак це пов'язано з таким недоліком як зменшення об'єму ("усихання"), що має місце в процесі зберігання, і злипання порошку, яке має місце в ході реконституци З точки зору подолання зазначених вище недоліків амінокислоти, сахариди або багатоатомні спирти використовуються відносно до ВМР-2 - біл ка, що класифікується у те ж саме суперсімейство TGF-P та характеризується властивостями, близькими до тих, які є у морфогенетичного фактора кістки МР52 людини (японський патент-А НЕЇ 6508777) 3 урахуванням цього, автори цього винаходу здійснювали спробу застосувати такі добавки до морфогенетичного фактора кістки МР52 людини, однак зазначені вище проблеми розв'язати не вдалося Конкретно, злипання в момент реконституци спостерігалося навіть тоді, коли до морфогенетичного фактора кістки МР52 людини додавали перед люфілізацією нейтральні або основні амінокислоти, такі як аланін, валін або лізин, в КІЛЬКОСТІ ВІД 0,5 до 2,5% У випадку додання перед люфілізацією сахаридів, таких як сахароза чи декстран, в КІЛЬКОСТІ від 0,5 до 1%, у люфілізованого продукту спостерігалися поява блідої жовтувато-зеленої забарвленості й усихання При додаванні перед люфілізацією багатоатомного спирту, такого як сорбіт, в КІЛЬКОСТІ від 0,5 до 1%, в процесі люфілізацп відбувалося розчинення морфогенетичного фактора кістки МР52 людини, що робило неможливим одержання люфілізованого продукту Авторами цього винаходу були проведені ш 00 о ю 50811 тенсивні дослідження з метою подолання зазначених вище недоліків В результаті було виявлено, що при доданні до морфогенетичного фактора кістки МР52 людини маніт перед люфілізацією ані появи забарвленості, ані усихання в процесі зберігання люфілізованого продукту не відбувається, а в момент реконституцм не відбувається злипання, що дозволило вважати цей винахід завершеним Таким чином, даний винахід являє собою люфілізовану композицію морфогенетичного фактора кістки МР52 людини, що містить морфогенетичний фактор кістки МР52 людини та маніт В якості морфогенетичного фактора кістки МР52 людини ВІДПОВІДНО де винаходу більш прийнятно використовувати морфогенетичний фактор кістки МР52 людини (який може надалі також позначатись як "rhMP52"), одержуваний з застосуванням технологій генетичної інженери, описаних в WO 96/33215 В якості маніту більш прийнятно використовувати D-маніт, охарактеризований Фармакопеєю Японії Більш прийнятним є змішування морфогенетичного фактора кістки МР52 людини і маніту у ваговому відношенні 1 5 - 5 0 Композиція ВІДПОВІДНО ДО винаходу може бути приготована шляхом люфілізацм водного розчину морфогенетичного фактора кістки МР52 людини і маніту з використанням стандартної процедури Більш докладно, композиція ВІДПОВІДНО ДО винаходу утворюється шляхом додання наперед визначеної КІЛЬКОСТІ маніту до водного розчину очищеного морфогенетичного фактора кістки МР52 людини, перемішування, фільтрування одержаного в результаті водного розчину суміші, приміщення фільтрату в стерильну ампулу і проведення люфілізацм Композиція ВІДПОВІДНО ДО винаходу вводиться пацієнту в КІЛЬКОСТІ, що є ефективною в зв'язку з лікуванням, що проводиться, після розчинення в дистильованій воді для ІН'ЄКЦІЙ або в слабкій кислоті (рН=3), наприклад, в розчині соляної кислоти або лимоннокислому буфері, з подальшим застосуванням Більш прийнятну КІЛЬКІСТЬ маніту, який вноситься в композицію ВІДПОВІДНО до винаходу, визначали, виходячи з тесту на стабільність Тест на стабільність проводили згідно з методом, описаним в інструкції для стандартної процедури, прийнятої Фармакопеєю Японії XIII, в якому спостерігають і вимірюють такі властивості як ЗОВНІШНІЙ вигляд і прозорість розчину, електрофоретичні параметри та вміст води в момент початку тесту і через 3 МІСЯЦІ, а також контроль формування ектопічної кісткової тканини через 6 МІСЯЦІВ В результаті жодних змін у зовнішньому вигляді та прозорості розчину не було виявлено на початку тестування і через 3 МІСЯЦІВ ПІСЛЯ ЦЬОГО За даними електрофоретичних вимірів і визначення вмісту води препарати, які містять маніт в описаному вище ваговому співвідношенні, характеризувалися стабільністю на початку тесту і через З МІСЯЦІВ після цього Відомо, ЩО більш прийнятний вміст води в ліофілізованому продукті в цілому становить 2% або менше Виходячи з описаних вище результатів, вважають, що більш прийнятним фармацевтичним продуктом є композиція морфогенетичного факто ра кістки МР52 людини, яка включає маніт в КІЛЬКОСТІ ВІД 5 до 50мг, а бажано 10мг, в розрахунку на 1мг морфогенетичного фактора кістки МР52 людини Крім того, формування ектопічної кісткової тканини під дією кожної люфілізованої композиції морфогенетичного фактора кістки МР52 людини, що включає 10, 25 і 50мг маніту, оцінювали після 6-місячного зберігання В результаті формування ектопічної кісткової тканини було відзначене для будь-яких композицій, незалежно від температури зберігання або КІЛЬКОСТІ маніту На основі описаних вище результатів проведених тестів вважається підтвердженим, що додання маніту до морфогенетичного фактора кістки МР52 людини перед люфілізацією не виявляє негативного впливу на морфогенетичний фактор кістки МР52 людини одержувана в результаті композиція залишається стабільною впродовж тривалого періоду часу Найкращі шляхи реалізації винаходу Даний винахід може бути більш докладно охарактеризовано за допомогою наведених нижче прикладів Приклад 1 Приготування композиції rhMP52 До 1мг/мл водного розчину очищеного rhMP52, який одержали з використанням процедури, описаної у WO 96/33215, додавали D-маніт (Фармакопея Японії) в КІЛЬКОСТІ 10, 25 і 50мг, ВІДПОВІДНО, та перемішували Після відфільтровування одержаної в результаті суміші крізь мембранний фільтр з діаметром пор 0,22мкм порції одержаного таким чином фільтрату по 1мл приміщували в ампули за стерильних умов, їх піддавали люфілізацм, одержуючи таким чином композицію ВІДПОВІДНО ДО винаходу у формі фармацевтичного продукту Приклад 2 Тест на стабільність композиції rhMP52 Люфілізовану композицію rhMP52, одержану в прикладі 1, приміщували в прозору герметичну пляшечку та зберігали при температурі 2 - 8°С, 25°С і 40°С, ВІДПОВІДНО Стабільність оцінювали через три МІСЯЦІ згідно з такими критеріями Критерії оцінки були такими Властивості ЗОВНІШНІЙ ВИГЛЯД КОМПОЗИЦІЯ, ЩО зберігала форму білої лепішки і не змінювала свого кольору, визначалася як така, що "не змінилася" Прозорість розчину розчин, що містить композицію, розчинену в 1мл дистильованої води, призначений для проведення ІН'ЄКЦІЙ, визначали як такий, що "не змінився" тоді, коли він був безбарвним, прозорим і не мав частинок, які позлипалися Електрофорез чистоту основної смуги розраховували за площею, яку вона займає у відсотках, що визначається при внесенні електрофоретичної картинки у плівковий сканер, обладнаний червоним фільтром, що дозволяє визначати інтегральну оптичну ЩІЛЬНІСТЬ (IOD) у відсотках для кожної смуги Вміст ВОДИ ВМІСТ ВОДИ В КОМПОЗИЦІЇ вимірюва ли за допомогою мікровимірника води В результаті, що стосується властивостей, композиція ВІДПОВІДНО до винаходу залишилася незмінною щодо зовнішнього вигляду та прозорості розчину, у той час як злипання було виявлено у чистому люфілізованому продукті rhMP52 При 50811 проведенні електрофорезу для кожної композиції був продемонстрований гарний рівень стабільності (у %%) Результати вимірювання вмісту води (в %% наведені в таблиці 1, яка показує, що ІСТОТНІ ЗМІНИ у ВМІСТІ води (%%) при порівнянні композицій від 6 сутні Таблиця 1 показує, що, порівняно з варіантом, який включає в себе лише rhMP52, вміст води в кожній з композицій ВІДПОВІДНО до винаходу виявляється меншим в момент приготування або після зберігання ВІДПОВІДНО, усихання не спостерігається Таблиця 1 Композиція ТІЛЬКИ rhMP52 + маніт, Юмг + маніт, 25мг + маніт, 50мг Через 3 МІСЯЦІ Спочатку 2-8°С 9,2% 1,6% 0,7% 0,5% 9,7% 1,6% 0,9% 0,6% Приклад 3 Формування ектопічної кісткової тканини під контролем rhMP52 По одній ампулі (1мг на 1 посудину), що містить композицію rhMP52, одержану в прикладі 1, зберігали протягом 6 МІСЯЦІВ при 4°С і 25°С, ВІДПОВІДНО ПОТІМ В ампулу додавали 1мл дистильованої води з одержанням розчину, призначеного для 25°С 7,6% 1,4% 0,6% 0,4% 40°С 7,8% 1,2% 0,5% 0,4% введення з допомогою ін'єкції Приготований таким чином розчин внутрішньо м'язово ін'єкували мишам лінії ICR (Nippon Crea Co Ltd) в дозі 20мкг/20мл Через дві тижні присутність або відсутність формування ектопічної кісткової тканини аналізувала Із застосуванням м'якої рентгенографи (п=2) Результати подано в таблиці 2 Таблиця 2 Композиція ТІЛЬКИ rhMP52 + маніт, Юмг + маніт, 25мг + маніт, 50мг 4°С спостерігалося ФЕКТ* спостерігалося ФЕКТ спостерігалося ФЕКТ спостерігалося ФЕКТ 25°С спостерігалося спостерігалося спостерігалося спостерігалося ФЕКТ ФЕКТ ФЕКТ ФЕКТ *ФЕКТ - формування ектопічної кісткової тканини Промислове застосування Люфілізований продукт морфогенетичного фактора кістки МР52 людини пов'язаний з таким проблемами як поява кольору або висихання в процесі зберігання чи злипання при проведенні реконституцм Однак з люфілізованою композицією ВІДПОВІДНО до винаходу таких проблем не виникає Морфогенетичний фактор кістки МР52 людини у вигляді люфілізованої композиції ВІДПОВІДНО ДО винаходу залишається стабільним і не зазнає істотних змін в своїй чистоті, ВМІСТІ води та контролі формування ектопічної кісткової тканини після зберігання впродовж тривалого часу Таким чином, цей винахід є застосовним у галузі приготування фармацевтичного продукту ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044) 456 - 20 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71