Спосіб одержання стовбурових клітин

1. Спосіб одержання стовбурових клітин, що включає відмивання ліпоаспірату й обробку його ферментом, дезактивацію ферменту, відділення стовбурових клітин центрифугуванням, ресуспендування в середовищі для культивування та висівання клітинної суспензії у флакони, який відріз 3 пендування в середовищі для культивування та висівання у флакони. Причинами, що перешкоджають одержанню потрібного результату є не досить вдала методика виділення стовбурових клітин з організмів щурів, яка не може забезпечити високий вихід стовбурових клітин. За найближчий аналог вибрано спосіб одержання стовбурових клітин з ліпоаспірату [патент Російської Федерації № 2 306 335, МПК C12N 5/08; C12N 5/10; C12N 15/63 (2006.01), опубліковано 20.09.2007 Бюл. № 26], який передбачає використання ліпоаспірата, отриманого методом ліпосакції, який одержують від пацієнтів, що піддаються вибірковому хірургічному втручанню. Ліпоаспірат проціджують для відділення сторонніх шматочків жирової тканини від рідини. Виділену тканину ретельно промивають нейтральним фосфатним буферним розчином і потім ферментативно розщеплюють шляхом переривчастого перемішування з розчином 0,075 (масо-об'ємна концентрація) колагенази протягом 20 хвилин за температури 37 С. Потім колагеназу нейтралізують, а суспензію центрифугують при 260g протягом 10хв., що дає багатошарову надосадову рідину (супернатант) і клітинні кульки. Супернатант видаляють і зберігають для подальшого застосування, а кульки повторно суспендують в розчині, що лізує еритроцити, й інкубують без перемішування при 25 С протягом 10хв. Після інкубації середовище нейтралізують, а клітини знову центрифугують при 250g протягом 10хв. Після другого центрифугування клітини суспендують й оцінюють на життєздатність (з використанням виключення по трипану синьому) та визначають кількість клітин. Після цього клітини поміщають при щільності приблизно 1 106 клітин/100мм чашку. їх культивують при 37 С в середовищі DMEM + навколоплідна теляча сироватка (приблизно 10 ) у приблизно 5 СО2. Більшість одержаних клітин були липкими, невеликого розміру, моноядерними, фібробластоподібними клітинами, що не містять видимих крапельок жиру. Більшість клітин забарвлювалося негативно масляним червоним О, а також за методом фон-Косса. Клітини не ідентифікувалися як міоцити, адипоцити, хондроцити, остеоцити або клітини крові. Спільними ознаками з корисною моделлю, що заявляється, є: відмивання ліпоаспірата й обробка його ферментом, дезактивація ферменту, виділення стовбурових клітин центрифугуванням, ресуспендування в середовищі для культивування та висівання у флакони. Причинами, що перешкоджають одержанню потрібного результату, є багатостадійна складна методика одержання стовбурових клітин. В основу корисної моделі поставлена задача у способі одержання стовбурових клітин шляхом зміни параметрів та введення нових реагентів забезпечити спрощення процесу при збереженні значної кількості життєздатних клітин. Поставлена задача вирішується тим, що у способі одержання стовбурових клітин, який включає відмивання ліпоаспірата й обробку його ферментом, дезактивацію ферменту, виділення стов 51111 4 бурових клітин центрифугуванням, ресуспендування в середовищі для культивування, та висівання клітинної суспензії у флакони, згідно з корисною моделлю, як фермент беруть проназу у вигляді 0,1 - 0,3 -ного розчину в середовищі Ігла в модифікації Дюльбекко у співвідношенні з ліпоаспіратом від 1:0,5 до 1:2, для дезактивації ферменту суспензію розбавляють у 2-3 рази фосфатносольовим буферним розчином, виділення стовбурових клітин центрифугуванням ведуть при 1500 2000об/хв. протягом 15-20хв. Згідно з корисною моделлю, як середовище для культивування беруть середовище Ігла в модифікації Дюльбекко, 10 - 20 ембріональної телячої сироватки, антибіотики й антимікотики. Згідно з корисною моделлю, клітинну суспензію висівають у флакони з розрахунку (1-5) 104 ядровмісних клітин/см2. Технічним результатом способу, що заявляється, є спрощення процесу виділення стовбурових клітин при збереженні значної кількості життєздатних клітин. Із 1г жирової тканини спосіб, що заявляється, дозволяє одержати (3,2-4,5) 104 стовбурових клітин. Спосіб, що заявляється здійснюють так. Ліпоаспірат промивають 3 рази фізіологічним розчином або фосфатним буферним розчином з антибіотиками й антимікотиками. Промиту фракцію обробляють розчином ферменту пронази. Для цього до ліпоаспірату у співвідношенні від 1:0,5 до 1:2 додають розчин пронази у вигляді (0,1-0,4 ) розчину в середовищі Ігла в модифікації Дюльбекко (DMEM) з додаванням антибіотиків та антимікотиків. Суміш витримують при постійному перемішуванні протягом 0,5-2год. за температури 37 0,5 С. Для дезактивації ферменту об'єм суспензії розбавляють фосфатно-сольовим буферним розчином клітин в 2-3 рази. Клітини відділяють від рідкої фази центрифугуванням при 1000-2500об/хв. протягом 10-20хв. Осад клітин ресуспендують в середовищі для культивування, висівають з розрахунку (1-6) 104 ядровмісних клітин/см2 у флакони площею 75см2 із середовищем DMEM, 10 - 20 ембріональної телячої сироватки з додаванням антибіотиків та антимікотиків. Кількість та життєздатність одержаних клітин визначають методами світлової мікроскопії та проточної цитофлуориметрії. Можливість здійснення способу, що заявляється, підтверджується наступними прикладами. Приклад 1. Ліпоаспірат промивають 3 рази фізіологічним розчином з антибіотиками й антимікотиками. До промитої субстанції у співвідношенні 1:0,5 додають 0,4 -ний розчин пронази в DMEM з додаванням антибіотиків та антимікотиків і витримують при постійному перемішуванні протягом 0,5год. за температури 37 0,5 С. Потім суспензію розбавляють фосфатно-сольовим буферним розчином в 3 рази. Клітини відділяють від рідкої фази центрифугуванням при 1500об/хв. протягом 20хв. Осад клітин ресуспендують в середовищі для культивування, висівають з розрахунку 6 104 ядровмісних клітин/см2 у флакони площею 75см2 із середовищем Ігла в модифікації Дюльбекко, 15 5 51111 ембріональної телячої сироватки, з додаванням антибіотиків та антимікотиків. Кількість та життєздатність одержаних клітин визначають методами світлової мікроскопії та проточної цитофлуоримет 6 рії. Одержано у розрахунку на 1г ліпоаспірата 4 104 життєздатних стовбурових клітин. Таблиця Додавання р-ну пронази Роз- Відділення клітин Вміст ембріональної телячої ПромивеОдержано з 1г КонЧас сироватки в се№ прикла- вання Час ден- Центрицентр співвідноцентрифу- редовищі для ліпоаспірата, ду ліпоаспівитрат, ня фугуванація, 104 клітин шення гування, культивування, рата, раз год. сусп., ня об/хв. хв. раз 1 3 0,4 1:0,5 0,5 3 1500 20 15 3,4 2 3 0,2 1:1 1 2 2000 15 10 4,5 3 2 0,1 1:2 2 3 1700 17 20 3,2 Приклади 2 та 3. Одержання стовбурових клітин проводили так, як описано у прикладі 1, за винятком того, що змінювали параметри процесу. Числові значення параметрів способу, а також кількість життєздатних стовбурових клітин, виділених з 1г, наведено у прикладах 2 та 3 таблиці. Наведені приклади підтверджують можливість досягнення технічного результату. Число стовбу Комп’ютерна верстка А. Крижанівський рових клітин, виділених з 1г ліпоаспірата становить (3,2-4,5) 104 життєздатних клітин. Спосіб, що заявляється, відносно простий, може здійснюватись з використанням стандартного обладнання без значних затрат на вдосконалення. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601