Штам brucella ovis 67/б для виготовлення інактивованої емульсин-вакцини проти інфекційного епідидиміту баранів

Штам Brucella ovis 67/Б для виготовлення шактивованої емульсин-вакцини проти інфекційного епідидиміту баранів, який депонований та зберігається за номером 219 у колекції мікроорганізмів лабораторії вивчення хвороб рогатої худоби Інституту експериментальної та клінічної ветеринарної медицини УААН, м Харків, Україна Винахід відноситься до ветеринарної мікробіологи та біотехнологм, зокрема до виготовлення імуногенних штамів Brucella ovis, які використовують для виробництва вакцин проти інфекційного епідидиміту (IE) баранів Відомо про штам В ovis 64 (колекція ВІЕВ, Росія), який використовують для виготовлення шактивованої емульсин-вакцини проти IE баранів (Ветеринария — 1998 — №3, С 15-20) Використання цього штаму в біологічній промисловості України неможливе за його відсутністю Для розробки засобів специфічної профілактики інфекційного епідидиміту баранів необхідно мати ВІТЧИЗНЯНІ високоімуногенні штами В основу винаходу, що передбачається, поставлено завдання знайти імуногенний штам Brucella ovis для виготовлення шактивованої емульсин-вакцини проти інфекційного епідидиміту баранів, шляхом дослідження музейних і польових штамів В ovis 67 Б для виготовлення інактивованоі емульсин-вакцини проти інфекційного епідидиміту баранів, який депонований та зберігається за номером 219 у колекції мікроорганізмів лабораторії вивчення хвороб рогатої худоби Інституту експериментальної та клінічної ветеринарної медицини УААН, м Харків, Україна Вакцинний штам В ovis 67/Б має стабільну Rформу й вирощується на м'ясо-печшковому пептонно-глюкозо-гліцериновому агарі (МППГГА) з 10% сироватки крові великої рогатої худоби (ВРХ) рН 7,0 - 7,2 в умовах збільшеної КІЛЬКОСТІ СОг в атмосфері при 137 - 38°С Штам має такі культурально-морфолопчні та антигенні властивості - у посівах на МППГГА з сироваткою через 72 години виростають дрібні, круглі, випуклі, напів прозорі колонії з сіро-блакитним ВІДТІНКОМ В прохідному СВІТЛІ Після фарбування 0,05% розчином кристал-вюлету за Уайт-Вілсоном 4 - 5 добової культури у чашках Петрі колонії мають синьофіолетове забарвлення, - на м'ясо-печінковому пептонно-глюкозогліцериновому бульйоні (МППГГБ) - слабке помутніння з осадом у вигляді аглютинату, - штам не продукує сірководень, - росте у напіврідкому агарі з тюнином у концентрації 1 50000 і не росте з основним фуксином у такій же концентрації, - в мазках, пофарбованих за Козловським, Стемпом або Грамом (Настанова по діагностиці бруцельоза тварин — Київ — 1998, С 6) мають форму дрібних коків та поліморфних паличок червоного кольору (0,5 - 0,7 х 0, 7 -1,2мкм), - бактерії аглютинуються в трипафлавіновій пробі і реакції термоаглютинацм, - культура аглютинується R-родо- і видоспецифічними бруцелаовісними сироватками і не аглютинується S-бруцельозною сироваткою Штам вільний від контамінації іншої бактеріальної мікрофлори та грибами Підтримання штаму проводять шляхом пересіву з інтервалом 1 , 5 - 2 МІСЯЦІ на середовищі МППГГА з 10% сироватки ВРХ в умовах збільшеної КІЛЬКОСТІ СОг в атмосфері вирощування Основні умови зберігання - штам зберігають в пробірках на МППГГА з 10% сироватки ВРХ під гумовими пробками або у люфілізованому стані в ампулах при 14 - 10°С Імуногенні властивості штаму В ovis 67/Б пояснюються наступними прикладами Приклад 1 В ДОСЛІДІ на 48 морських свинках вивчали імуногенність двох музейних (65939 і со Ю 51379 "Болград") і двох польових (7807 і 8206) штамів В ovis з колекції культур бруцел лабораторії вивчення хвороб рогатої худоби Культури штамів вирощували на МППГГА з 10% сироватки ВРХ в умовах збільшеної КІЛЬКОСТІ СОг в атмосфері вирощування впродовж 3-х діб Культуру бактерій змивали фізіологічним 0,85% розчином натрію хлоріду Суспензію бруцела овіс шактивували формаліном в концентрації 0,4% при t 37°C одну добу, досліджували на стерильність і повноту інактивації у спосіб ВИСІВІВ на МППГГБ і МППГГА з сироваткою в умовах збільшеної КІЛЬКОСТІ СОг при t 37°С Інактивовану суспензію бруцела овіс змішували на гомогенізаторі з масляним ад'ювантом, контролювали вакцину на стерильність у спосіб ВИСІВІВ на МППГГБ, МППГГА з сироваткою, середовище Кітт-Тароцці при t 37°C, а також ВИСІВІВ на середовище Сабуро при t 22 - 24°С впродовж 10 діб Інактивовану емульсин-вакцину вводили під шкіру в об'ємі 1,0см3 Вакциною з кожного штаму провели щеплення по 2 групи морських свинок в дозах 200 тис і 200 млн м к , контрольним групам вводили підшкірно масляний ад'ювант з фізрозчином Контроль імунітету провели через 34 добу після щеплення шляхом зараження окремо кожної щепленої групи тварин суспензією штаму бактерій бруцела овіс, гомологічного вакцині, в дозі 2 млрд м к/см 3 підшкірно в об'ємі 1,0см3 Діагностичний забій, серологічні (PA, PT3K) і бактеріологічні дослідження провели через місяць після контрольного зараження Одержанні результати дослідження свідчать, що всі три штама в дозі 2 млрд м к заразили всіх морських свинок в контрольних групах з високим індексом інфікованності ( I I ) - 50,0 - 70,0% Серологічні зрушення в крові виявили в РА і РТЗК та були приблизно однакові в усіх групах щеплених морських свинок Протективні властивості були більшими у штаму "Болград" - 100,0% імунітет в обох групах, щеплених ВІДПОВІДНО 200 тис і 200 млн м к В групах морських свинок, щеплених другими штамами, напруження імунітету змінювалось в залежності від концентрації бактерій в вакцині Імунітет виявили при концентрації 200 тис і 200 млн м к ВІДПОВІДНО у 50 і 100% - для штаму 7807, у 25 і 75% - для штаму 8206 Штам 65939 в дозі 200 тис м к виявився не імуногенним, а в дозі 200 млн м к - імунітет був у 75% тварин Таким чином, штам В ovis 67/Б ("Болград") використовували як перспективний для виготовлення мікросерій шактивованої емульсин-вакцини Приклад 2 По технологи, що наведена в прикладі 1, виготовили дві мікросерм шактивованої емульсин-вакцини з штаму В ovis 67/Б Двом дослідним групам морських свинок по 12 голів вводили під шкіру вакцину в дозі 20 і 200 млн м к в об'ємі 0,5см , контрольній групі (11 голів) - ад'ювант з фізрозчином Серологічні дослідження, проведені до зараження, виявили в сироватці всіх щеплених морських свинок антитіла в РТЗК в титрі 1 5 - 1 1 0 (0,93 ± 0,041 д) і в РІД - позитивна реакція з бруцелаовісним антигеном Через 2 МІСЯЦІ ПІСЛЯ вакцинації тварин щеплених і контрольної груп заразили вірулентним штамом В ovis 8406 підшкі рне в дозі 2 млрд м к Діагностичний забій, серологічні та бактеріологічні дослідження провели через 45 діб після зараження У щеплених тварин бруцелаовісна серопозитивність становила в РТЗК 1 5 - 1 1 0 (0,98 ± 0,021 д) та РІД В контрольній групі інфікованих морських свинок виявили 81,8% реагуючих в РТЗК в титрі не більше 1 5 і 36,4% тварин - в РІД Бактеріологічними дослідженнями імунітет в 1-й групі виявлено у 11 з 12 морських свинок (91,6%) і в 2-й групі у всіх 12 морських свинок (100%) В контролі культуру В ovis виділили у 10 (90,9%) морських свинок з І І -36,8% Встановлено також, що щеплення емульсин-вакциною не викликала бруцельозної серопозитивності з Sантигеном в РБП, РА і РЗК Приклад 3 По технологи, що наведена в прикладі 1, виготовили експериментальну серію № 1 шактивованої емульсин-вакцини з штаму В ovis 67/Б Концентрація бруцел в серп вакцини склала 2,5 млрд м к/см 3 Випробування вакцини на антигенність та імуногенність провели в двох дослідах на 10 вакцинованих і 8 контрольних баранах в ВІЦІ 9 МІСЯЦІВ Вакцину інокулювали підшкірне в області паху в дозі 5 млрд м к в об'ємі 2,0см Контрольним 4-м баранам вводили ад'ювант на фізрозчині, а другим чотирьом баранам препарат не застосовували Через 6 (дослід 1) і 12 (дослід 2) МІСЯЦІВ ПІСЛЯ вакцинації щеплених та контрольних баранів заразили суспензією 3-х добової культури бруцела овіс в концентрації 5 млрд м к штаму В ovis 8406 і штаму В ovis 08337 шляхом аплікації по 0,1см3 на кон'юнктиву обох очей та по 0,8см3 на слизову препуція Діагностичний забій і бактеріологічне дослідження провели через ЗО - 58 діб після зараження При дослідженні в РА, РТЗК, РІД з бруцелаовісним антигеном у вакцинованих баранів в двох дослідах виявили серопозитивність до зараження Бруцелаовісна серопозитивність зберігається до кінця дослідження в першому ДОСЛІДІ титри в РА були - 1 25 - 1 100 (1,76 ± 0,131д), РТЗК - 1 1 0 1 80(1,36±0,161д), Р І Д - 1 4 - 1 16(2,2±0,72Іод 2 ), в другому ДОСЛІДІ титри в РА - 1 25 - 1 100 (1,7 ± 0,141д), РТЗК- 1 5 - 1 80 (1,3 ± 0,281д), РІД- 1 3 2 1 64 (5,3 ± 0,55Іод2) Бактеріологічне дослідження після контрольного зараження через 6 і 12 МІСЯЦІВ були ВІД'ЄМНІ, ІДО показує повний захист щеплених тварин В контрольних інфікованих групах після зараження барани позитивно реагували в серологічних реакціях з бруцелаовісним антигеном в першому ДОСЛІДІ титри в РА - 1 25 (1,4 ± 0,1д), РТЗК - 1 5 (0,35 ± 0,231 д) і в РІД -позитивно, в другому ДОСЛІДІ титри в РА - 1 25 - 1 50 (1,2 ± 0,461 д), РТЗК 1 10 (1,0 ± 0,1д), РІД - 1 8 - 1 16 (3,8 ± 0,28Іод2) В контрольних групах ВИДІЛИЛИ культуру заражаючого штаму В ovis в першому ДОСЛІДІ у 3-х з 4-х баранів з І І - 31,2% та у 2-х з 4-х в другому ДОСЛІДІ З І І -23,1% Встановлено також, що щеплення шактивованою емульсин-вакциною проти IE баранів не викликає бруцельозної серопозитивності з Sантигеном в РБП, РА та РТЗК, що забезпечує можливість серологічне контролювати на бруцельоз щеплених тварин 51379 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71