Речовина з цитотоксичною дією

Речовина органічного походження, яка відрізняється тим, що має цитотоксичну та протипухлинну активність, одержана у вигляді білка з молекулярною масою 18,5 кДа з фільтрату культуральної рідини штаму B.subtilis B-7025 методом висолювання сульфатом амонію, за умови насичення розчину до 40 %. (19) (21) u200913441 (22) 23.12.2009 (24) 25.08.2010 (46) 25.08.2010, Бюл.№ 16, 2010 р. (72) ДІДЕНКО ГЕННАДІЙ ВАСИЛЬОВИЧ, RU, ШПАК ЄВГЕН ГРИГОРОВИЧ, ЄВТУШЕНКО ОЛЕГ ІВАНОВИЧ, ЛІСОВЕНКО ГАЛИНА СТЕПАНІВНА, ДВОРЩЕНКО ОЛЕГ СТАНІСЛАВОВИЧ, ПОТЕБНЯ ГРИГОРІЙ ПЛАТОНОВИЧ, ЧЕХУН ВАСИЛЬ ФЕДОРОВИЧ 3 52251 ню до злоякісних пухлин різного гістогенезу, з гальмуванням росту пухлини від 9 до 57,8%. Його виділяють з культуральної рідини штамупродуцента B.subtilis 668 ІMB шляхом висолювання сульфатом амонію до 70% насичення. Однак зазначений бактерійний лектин не забезпечує стовідсоткову протипухлинну цитотоксичну активність. Значно ефективнішими виявились продукти метаболізму у фільтраті культуральної рідини (ФКР) мікробного походження мікроорганізму В. subtilis B-7025, для яких є характерним підвищений синтез цитотоксичних речовин та компоненти якого запускають каскад реакцій, які призводять до формування повноцінної імунної відповіді. Задачею способу, що заявляється, є розширення арсеналу речовин органічного походження з цитотоксичною дією за рахунок виділеного з фільтрату культуральної рідини Bacillus subtilis 5-7025 окремого білкового компоненту мікробного синтезу, який проявляє виражену цитотоксичну дію на ПК. Вирішення поставленої задачі досягається тим, що речовина органічного походження, яка відрізняється тим, що має білкову природу, виділена з фільтрату культуральної рідини (ФКР) штаму В.subtilis B-7025 методом фракціонування білків методом висолювання сульфатом амонію до 40% насичення у вигляді білка з молекулярною масою 18,5кДа і має цитотоксичну та протипухлинну активність. Речовину виділили наступним чином. Для поділу ФКР на окремі складові використано такі методи - етанольна преципітація (самостійна та з подальшою термообробкою); іонообмінна хроматографія з використанням ДЕАЕ-целюлози; колонкова хроматографія з TOY0PEARL G10; фракціонування білків методом висолювання сульфатом амонію. Білковоий склад фракцій (Фр), оцінювали за допомогою SDS-елекрофорезу. Відбір Фр здійснювали за проявом цитотоксичної дії на ПК та за зда 4 тністю викликати якісні зміни на мембрані або в цитоплазмі останніх. Максимальний термін спостереження дії окремих Фр на ПК - 4год. Протягом терміну інкубації ПК з досліджуваними Фр, кожні 30хв. робили цифрові знімки (під світловим мікроскопом) препаратів ПК, забарвлених розчином трипанового синього. Для ідентифікації білкового компоненту з найбільш вираженим цитотоксичним ефектом (ним виявився компонент 18,5кДа), досліджували його цитотоксичну дію. Цитотоксичну дію досліджували на клітинах асцитної форми S37. ПК інкубували з досліджуваним компонентом 18,5кДа протягом 2год. З суспензії ПК, яку інкубували з компонентом 18кДа, кожні 15хв. готували фіксовані препарати. Отримані препарати забарвлювали за методом Романовського-Гімза, що дозволяло визначати клітини з морфологічними ознаками некрозу. Компонент 18,5кДа виділений з культуральної рідини штаму мікроорганізму B.subtilis, депонований у колекції Інституту мікробіології та вірусології НАН України за номером В-7025. Даний білок має високу цитотоксичну і протипухлинну активність по відношенню до пухлин різного гістогенезу. У дослідженнях in vitro при концентрації його 0,3мг/мл спостерігається 100% цитотоксична активність по відношенню до 1,0 107 пухлинних клітин, а при вивченні протипухлинної активності in vivo в експерименті спостерігається гальмування пухлинного росту та подовження тривалості життя тварин на 50% - 90%. Цитотоксичну активність компоненту 18,5кДа, що заявляється, по відношенню до ПК визначали in vitro в цитотоксичній реакції, а протипухлинну активність його визначали in vivo в дослідженнях на тваринах. Він проявляє цитотоксичну активність по відношенню до ПК різного гістогенезу. Характеристика цитотоксичного компоненту 18,5кДа з протипухлинною активністю представлена в таблицях 1 і 2. Таблиця 1 Цитотоксична активність компоненту 18,5кДа (B.subtilis В-7025) та лектину 668 по відношенню до клітин саркоми-37 Компонент 18,5кДа B.subtilis В-7025 (заявлений) B.subtilis 668 (прототип) Кількість пухлинних клітин в 1мл 1,0 107 1,0 107 З наведених в таблиці даних видно, що цитотоксична активність компоненту 18,5кДа в 4 рази перевищує активність лектину 668. Для того, щоб підтвердити протипухлинну активність компоненту 18,5кДа були проведені експериментальні дослідження. Мишам лінії BALB/c прищеплювали підшкірне по 3,0 106 пухлинних клітин саркоми-37, лікування проводили триразове (на 1, 4, 9 добу) за допомогою компоненту 18,5кДа Концентрація мг/мл 0,3 0,7 Цитотоксична активність, % 100,0 25,0 В-7025 та лектину B.subtilis 668 (прототипу), з розрахунку: 1,0 107 пухлинних клітин + 0,15мг компоненту 18,5кДа B.subtilis В-7025; 1,0 107 пухлинних клітин + 1,0мг лектину B.subtilis 668. Результати оцінювали по гальмуванню пухлинного росту в порівнянні з контрольною групою та середній тривалості життя (СТЖ) піддослідних тварин (табл.2.). 5 52251 6 Таблиця 2 Порівняння ефективності компоненту 18,5кДа B.subtilis В-7025 та лектину B.subtilis 668 Компонент 18,5кДа B.subtilis В-7025 (заявлений) B.subtilis 668 (прототип) Контроль (фізіологічний розчин NaCI) Концентрація в 1 мл вакцини Гальмування пухлинного росту, % на 15 добу на 22 добу СТЖ пухлиноносіїв, доба Х±m t 0,15мг/мл 42,0±15,6* 38,6±15,3* 41,20±2,11 3,12* 1,0мг/мл 2,8±5,5 4,7±7,1 30,41±3,09 0,14 0 0 30,5±2,48 Примітка. * - різниця з контролем статистичне суттєва (р