Спосіб одержання речовини з протипухлинною активністю

Спосіб одержання речовини з протипухлинною аісгивністю шляхом культивування мікроорганізму, відокремлення культуральної рідини, осадження, спиртової екстракції і очищення, який відрізняється тим, що як штам-продуцент використовують штам Вас subtihs 1MB В-7025, культивують протягом 4-9 діб в середовищі Гаузе або екстракті пшеничних висівок, осадження проводять 0,4М НСІ при рН 3,0-4,0 з наступним витримуванням на холоді протягом 2-3 годин, а активну речовину екстрагують бутанолом у співвідношенні до води 2 1 з подальшим очищенням Винахід відноситься до медицини, а саме, до онкологи, і стосується технології одержання лікарських речовин бактерійного походження з протипухлинною цитотоксичною активністю Відомо, ЩО особливий інтерес для онкології викликають вуглеводзв'язуючі білки - лектини, які продукуються сапрофітними бактеріями Вас subtihs і мають широкий спектр біологічної активності Вони забезпечують внутрішні та МІЖКЛІТИННІ взаємодії, проявляють протипухлинні та імуномодулюючі властивості Враховуючи, що бактерійні лектини за ХІМІЧНОЮ природою є білки або глікопротеїди, для одержання активної речовини з культуральної рідини застосовують загальноприйняті в хімії білків методи, які грунтуються на здатності останніх висолюватися із водних розчинів при додаванні сульфату амонію чи інших солей, осаджуватися кислотами, різними об'ємами етанолу, ацетону та ш Відомий спосіб одержання бактерійного лектину з протипухлинною активністю із штаму Вас subtihs 668 1MB [Заявка №94063420 С12Р1/00 Штам Bacillus subtihs - продуцент позаклітинного сіалоспецифічного лектину / В'юницька В О , Коваленко Е О , Гетьман КІ Заявлено 30 06 94] Проте даний лектин не забезпечує необхідний рівень цитотоксичної та гемаглютинуючої активності по відношенню до пухлинних клітин Найбільш близьким аналогом до способу що заявляється є спосіб отримання речовини з протипухлинною активністю [Патент України №19910, МПК^СігРгі/ОО від 25 12 97 Пріор 26 10 82 Бюл №6, 1997] Прототип характеризується тим, що в якості штам а-продуцента речовини з протипухлинною активністю використовують штам Вас mesentencus АБ-56, який культивують на м'ясо-пептонному бульоні при 28-40°С протягом 5-6 діб Культуральну рідину центрифугують при 5000об/хв протягом 20хв В центрифугат додають 0,6% НСІ до рН 3,0, сформований осад центрифугують і обробляють 80%-ним етиловим спиртом з додаванням 6% NaOH до рН 7,2-7,6 Через 124год осад відокремлюють, а спиртовий екстракт випарюють і очищають Протипухлинна цитотоксична активність одержаної речовини в концентрації 0,06мг/мл по відношенню до асцитних пухлинних клітин становить 60-80% Вихід 6,8мг активної речовини з 1л культуральної рідини Однак відомим способом одержання речовини з протипухлинною активністю не можливо забезпечити 100%-ну протипухлинну цитотоксичну активність і високий вихід активної речовини Крім цього, для культивування штаму необхідно використовувати дороге поживне середовище В основу винаходу, що заявляється, поставлено задачу вдосконалення способу одержання речовини з протипухлинною активністю шляхом підбору штама-продуцента та створення ВІДПОВІД О ю 59472 них умов його культивування і очистки культуральної рідини з тим, щоб запезпечити 100%-ну протипухлинну цитотоксичну активність по відношенню до пухлинних клітин, суттєво підвищити вихід активної речовини та знизити затрати на поживне середовище для культивування даного штамупродуцента Поставлена задача вирішується тим, що в якості щтама-продуцента використовують штам Вас subtihs MB B-7025 [Заявка на винахід №2001042565 від 17 04 2001], культивують протягом 4-7 діб в середовищі Гаузе або екстракті пшеничних висівок, осадження проводять 0,4М HCL при рН 3,0-4,0 з наступним витримуванням на холоді протягом 2-Згод , а активну речовину екстрагують бутанолом у співвідношенні до води 2 1, з подальшим очищенням Удосконалення відомого способу почали з того, що методами аналітичної селекції із штаму Вас mesentericus АВ-56 одержали більш продуктивний штам Вас subtihs 1MB В-7025, який синтезує цитотоксичні речовини з вищою протипухлинною активністю Максимальний біосинтез цитотоксичних речовин штамом-продуцентом спостерігали на 4-5 добу в умовах періодичного культивування на качалках та на 6-9 добу в стаціонарних термостатних умовах при 28-40°С Використання для культивування даного штаму дешевшого поживного середовища Гаузе, оптимізованого для синтезу пектинів, і середовища на основі пшеничних висівок, яке використовується для біосинтезу протеолітичних ферментів, підвищило гемаглютинуючу і гемолітичну активність культуральної рідини Максимальне осадження активної речовини з культуральної рідини досягали додаванням до центрифугату 0,4М НС1 при рН 3,0-4,0, а найкраще формування осаду - витримуванням на холоді протягом 2-3 годин Повноту екстрагування активної речовини з осаду досягали бутанолом у співвідношенні до води 2 1 Спосіб одержання речовини з протипухлинною активністю здійснюють таким чином Штам Вас subtihs 1MB В-7025 культивують в напівсинтетичному середовищі Гаузе або екстракті пшеничних висівок при 28-40°С протягом 4-9 діб, культуральну рідину центрифугують 20 хвилин при 30005000об/хв для відокремлення мікробних клітин До центрифугату культуральної рідини з рН 7,0-9,2 при постійному перемішуванні додають 0,4М розчин НСІ до рН 3,0-4,0 і витримують на холоді 2-3 години Спостерігається інтенсивне помутніння і випадання осаду, який відокремлюють від рідкої фази центрифугуванням при 5000об/хв протягом 10 хвилин Надосадну рідину відкидають, а до осаду добавляють 80%-ний етиловий спирт та NaOH до рН 7,2-7,6 Одержаний екстракт концентрують в умовах вакууму до водного розчину і бутанолом екстрагують активну речовину Повноту переходу активної речовини в органічну фазу досягають 3-4-кратною екстракцією при співвідношенні вода бутиловий спирт 1 2 Із бутанольного концентрату по методу Блайя і Дайера виділяють ліпофільні речовини Водну фракцію концентрують під вакуумом, обезсолюють шляхом діалізу проти дистильованої води або на сефадексі Г-25 і висушують в вакуумі до сухої речовини Протипухлинну цитотоксичну активність одержаної речовини по відношенню до пухлинних клітин визначали in vitro в цитотоксичній реакції, а гемолітичну і гемаглютинуючу активність на еритроцитах (миши, кроля) в реакції гемаглютинації Речовина проявляла цитотоксичну активність по відношенню до асцитних пухлинних клітин різного гістогенезу (саркома-37, рак Зрліха, лімфома NK/Ly, лімфосаркома ОН-2, плазмоцитома ОН-3) Вона не тільки девіталізувала їх, але попередньо аглютинувала і частково лізувала пухлинні клітини, підсилюючи при цьому імуногенність останніх Ця властивість речовини покладена в основу приготування протипухлинної вакцини, яка використовується при активній специфічній імунотерапії в онкологи Аглютинуюча активність одержаної речовини по відношенню до еритроцитів і пухлинних клітин, а також цитотоксична дія на клітини злоякісних пухлин свідчить про те, що вона належить до класу пектинів Для підтвердження пектинової природи і ідентичності речовин, одержаних при вирощуванні культури Вас subtihs 1MB В-7025 на різних поживних середовищах, досліджені вуглеводзв'язуючи властивості Дуже висока специфічність одержаної речовини до фруктозо-1,6-дифосфату - інгибуюча реакцію гемаглютинації доза 0,05мМ до теперішнього часу не була відомою для пектинів Високу спорідненість відмічено також до Nацегилнейрамшової і D-глюкуроновоі кислот - інгібуючі реакцію гемаглютинації дози 1,9мМ і 7,5мМ, ВІДПОВІДНО Суть способу пояснюють приклади конкретного виконання Приклад 1 Штам Bacsubtius 1MB В-7025 культивують в поживному середовищі Гаузе при оптимальній температурі 5 діб в умовах періодичного культивування на качалках Культуральну рідину центрифугують при 3000об/хв для відокремлення мікробних клітин До центрифугату культуральної рідини з рН 8,0 при постійному перемішуванні додають 0,4М розчин НСІ до рН 3,0 і витримують на холоді 2 години Спостерігається інтенсивне помутніння і випадання осаду, який відокремлюють від рідкої фази центрифугуванням при 5000об/хв протягом 10 хвилин Надосадну рідину відкидають, а до осаду добавляють 80%-ний етиловий спирт та NaOH до рН 7,2 Одержаний екстракт концентрують в умовах вакууму до водного розчину і бутанолом екстрагують активну речовину Повноту переходу активної речовини в органічну фазу досягають 3-кратною екстракцією при співвідношенні вода бутиловий спирт 1 2 Із бутанольного концентрату виділяють ліпофільні речовини Водну фракцію концентрують під вакуумом, обезсолюють шляхом діалізу проти дистильованої води або на сефадексі Г-25 і висушують в вакуумі до сухої речовини Вихід речовини - 13,4мг з 1л культуральної рідини Цитотоксична активність одержаної речовини в концентрації 0,06мг/мл по відношенню до пухлинних клітин становить 100% Приклад 2 Штам Вас subtihs 1MB В-7025 культивують в 59472 поживному середовищі Гаузе при оптимальній температурі 8 діб в стаціонарних термостатних умовах Культуральну рідину центрифугують при 3000об/хв для відокремлення мікробних клітин До центрифугату культуральної рідини з рН 8,0 при постійному перемішуванні додають 0,4М розчин НСІ до рН 3,0 і витримують нахолоді 2 години Спостерігається інтенсивне помутніння і випадання осаду, який відокремлюють від рідкої фази центрифугуванням при 5000об/хв протягом 10 хвилин Надосадау рідину відкидають, а до осаду добавляють 80%-ний етиловий спирт та NaOH до рН7,2 Одержаний екстракт концентрують в умовах вакууму до водного розчину і бутанолом екстрагують активну речовину Повноту переходу активної речовини в органічну фазу досягають 3-кратною екстракцією при співвідношенні вода бутиловий спирт 1 2 Із бутанольного концентрату виділяють ліпофільні речовини Водну фракцію концентрують під вакуумом, обезсолюють шляхом діалізу проти дистильованої води або на сефадексі Г-25 і висушують в вакуумі до сухої речовини Вихід речовини - 13,5мг з 1л культуральної рідини Цитотоксична активність одержаної речовини в концентрації 0,06мг/мл по відношенню до пухлинних клітин становить 100% Приклад З Штам Вас subtihs 1MB В-7025 культивують в екстракті пшеничних висівок при оптимальній температурі 5 діб в умовах періодичного культивування на качалках Культуральну рідину центрифугують при 3000об/хв для відокремлення мікробних клітин До центрифугату культуральної рідини з рН 8,0 при постійному перемішуванні додають 0,4М розчин НСІ до рН 3,0 і витримують на холоді 2 години Спостерігається інтенсивне помутніння і випадання осаду, який відокремлюють від рідкої фази центрифугуванням при 5000об/хв протягом 10 хвилин Надосадау рідину відкидають, а до осаду добавляють 80%-ний етиловий спирт та NaOH до рН 7,2 Одержаний екстракт концентрують в умовах вакууму до водного розчину і бутанолом екстрагують активну речовину Повноту переходу активної речовини в органічну фазу досягають 4-кратною екстракцією при співвідношенні вода бутиловий спирт 1 2 Із бутанольного концентрату виділяють Комп'ютерна верстка Е Гапоненко ліпофільні речовини Водну фракцію концентрують під вакуумом, обезсолюють шляхом діалізу проти дистильованої води або на сефадексі Г-25 і висушують в вакуумі до сухої речовини Вихід речовини - 27,5мг з 1л культуральної рідини Цитотоксична активність одержаної речовини в концентрації 0,06мг/мл по відношенню до пухлинних клітин становить 100% Приклад 4 Штам Вас subtihs 1MB В-7025 культивують в екстракті пшеничних висівок при оптимальній температурі 8 діб в стаціонарних термостатних умовах Культуральну рідину центрифугують при 3000об/хв для відокремлення мікробних клітин До центрифугату культуральної рідини з рН 8,0 при постійному перемішуванні додають 0,4М розчин НСІ до рН 3,0 і витримують на холоді 2 години Спостерігається інтенсивне помутніння і випадання осаду, який відокремлюють від рідкої фази центрифугуванням при 5000об/хв протягом 10 хвилин Надосадау рідину відкидають, а до осаду добавляють 80%-ний етиловий спирт та NaOH до рН7,2 Одержаний екстракт концентрують в умовах вакууму до водного розчину і бутанолом екстрагують активну речовину Повноту переходу активної речовини в органічну фазу досягають 4-кратною екстракцією при співвідношенні вода бутиловий спирт 1 2 Із бутанольного концентрату виділяють ліпофільні речовини Водну фракцію концентрують під вакуумом, обезсолюють шляхом діалізу проти дистильованої води або на сефадексі Г-25 і висушують в вакуумі до сухої речовини Вихід речовини - 27,3мг з 1л культуральної рідини Цитотоксична активність одержаної речовини в концентрації 0,06мг/мл по відношенню до пухлинних клітин становить 100% Таким чином, заявлений спосіб одержання речовини з протипухлинною активністю дозволяє суттєво підвищити КІЛЬКІСНИЙ вихід активної речовини та забезпечити и 100%-ну протипухлинну цитотоксичну активність При цьому знижуються затрати на поживне середовище, необхідне для культивування штам у-продуцента Спосіб не вимагає додаткового спеціального обладнання і може широко застосовуватися при виробництві лікарських речовин бактерійного походження Підписано до друку 06 10 2003 Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна