Спосіб виявлення рнк ентеровірусів свиней b методом зворотно-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції

Спосіб виявлення РНК ентеровірусів свиней В методом зворотно-транскриптазної полімеразної 3 51552 4 Таблиця 1 Температурні і часові параметри ампліфікації специфічної ділянки кДНК ентеровірусів свиней В № циклу 1 2 3 4 5 Температура 95°С 94°С 60°С 74°С 94°С 60°С 73°С 72°С У результаті отримують продукт ампліфікації розміром 327 нуклеотидних пар. Після закінчення ампліфікації проби досліджують стандартним методом електрофорезу в агарозному гелі. Проведено дослідження 20 зразків, з яких: 16 - матеріал, інфікований штамами тешо-, ентеровірусів свиней, 2 - штамами коронавірусу, 2 - суспензії культур клітин СНЕВ та ВНК-21. У 9 зразках виявлено РНК ентеровірусів свиней В. Отже, розроблено спосіб виявлення РНК ентеровірусів свиней В на основі ЗТ ПЛР з використанням оригінальних штучно синтезованих олігонуклеотидних праймерів. Приклад. Пробу інфікованого матеріалу об'ємом 100мкл вносимо у пластикову пробірку ємністю 1,5см3 після чого виділяємо РНК набором реагентів для виділення РНК. У результаті отримуємо зразок рибонуклеїнової кислоти для постановки реакції зворотної транскрипції. Отриману в реакції зворотної транскрипції кДНК використовуємо для наступної постановки полімеразної ланцюгової реакції. Отриману кДНК (10мкл) поміщуємо у пробірку ємністю 0,5см3 і додаємо 15мкл ПЛР-буфера, 2,5мкл dNTP, по 2,5мкл праймерів, 0,25мкл Tag Комп’ютерна верстка Л. Купенко Час 5 хв. 1 хв. 1 хв. 1 хв. 0,5 хв. 0,5 хв. 0,5 хв. 5 хв. Зберігання Кількість циклів 1 5 35 1 полімерази та 1 краплю мінерального масла. Вміст пробірки струшуємо і центрифугуємо, а потім поміщуємо в ампліфікатор "Терцик", якому задаємо вищевказану програму. Детекцію продуктів реакції проводили за допомогою електрофорезу у 1,5% агарозному гелі (забарвленому бромідом етидію) з використанням трис-боратного буфера при градієнті напруги 10В/см. Результати оцінювали при перегляді гелю після електрофорезу на трансілюмінаторі під УФсвітлом по наявності (або відсутності) червонопомаранчевих фрагментів ДНК розміром 327 нуклеотидних пар. Наявність описаного фрагменту доводить присутність РНК ентеровірусів свиней В у досліджуваному зразку. Література: 1. Рекомендації з діагностики, профілактики та ліквідації тешо-, ентеровірусних енцефаломієлітів свиней / Сорока В.І., Бокун А.О., Дерев'янко С.В. та інш. - Чернігів: ЦНТЕІ, 2006. - 28с. 2. Detection of porcine enteroviruses by nRTPCR: differetion of CPE groups I-III specific primer sets / Zell R., Krumbholz A., Henke A. et al. // J. Virol. Methods. - 2000. - Vol. 88, №2. - P. 205-218. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601